SEMINAR KELAUTAN NASIONAL VII Inspiring Sea for Life : Tantangan dalam pengelolaan sumber daya secara bijaksana dan berkelanjutan Universitas Hang Tuah, Surabaya 20 April 2011
Rhizobakteria di rhizosfer Avicennia marina dan Pluchea indica di Pantai Wonorejo, Pantai Timur Surabaya Maya Shovitri, Tutik Nurhidayati, Enny Zulaika, Nova Maulidina Ashuri dan Purwati Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya Email :
[email protected] Abstrak Antara tanaman dan rhizobakteria yang hidup di perakarannya ada keterkaitan nutrisi yang unik. Tanaman mengeluarkan eksudat ke rhizosfernya dan rhizobakteria mendekomposisi senyawa eksudat tersebut menjadi energi dan senyawa prekursor organik dan anorganik yang bermanfaat untuk rhizobakteria dan tanaman kembali. Pantai Wonorejo di kawasan Pantai Timur Surabaya didominasi oleh tanaman Avicennia marina dan Pluchea indica yang hidup pada rentang salinitas berbeda. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan rhizobakteria yang hidup di rhizosfer kedua tanaman tersebut di dua salinitas berbeda 15,33‰ dan 7‰. Isolasi dan penentuan kecenderungan isolat ke suatu genus tertentu dilakukan berdasarkan kesamaan karakter biokimia menurut Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, The 9th Edition. Profil protein untuk menggambarkan sintesis protein oleh rhizobakteria di kedua rhizosfer dan salinitas juga dilakukan dengan metode SDS-PAGE 12%. Hasil menunjukkan bahwa komposisi rhizobakteria berbeda bila jenis tanaman dan salinitas juga berbeda. Pada rhizosfer A. marina yang bersalinitas lebih tinggi (15.33‰) mempunyai komposisi rhizobakteria yang lebih beragam dengan genus Bacillus, Amphibacillus, Lampropedia, Acinetobacter dan Planococcus, daripada yang bersalinitas rendah (7.00‰) dengan genus Bacillus dan Alteromonas. Sebaliknya di rhizosfer P. indica, rhizobakteria lebih beragam di salinitas rendah (7.00‰) dengan genus Bacillus, Citrobacter, Edwardsiella, Sporosarcina, Listeria, Salmonella, Azotobacter dan Flavobacterium, daripada di salinitas tinggi (15.33‰) dengan genus Listeria, Klebsiella dan Brochothrix. Profil protein menunjukkan bahwa rhizobakteria di rhizosfer A. marina dan P.indica selain mensintesis protein yang sama, juga mensintesis protein yang berbeda. Selain ada/tidaknya pita protein, ketebalan pita protein juga berbeda. Perbedaan profil protein juga terlihat di dua salinitas yang berbeda. Di rhizosfer yang sama, di salinitas 15.33‰ protein yang disintesis oleh rhizobakteria lebih banyak jenisnya daripada di salinitas 7.00‰. Ini mengindikasikan bahwa protein diperlukan untuk beradaptasi terhadap salinitas. Kata kunci : rhizobakteria, rhizosfer A.marina dan P.indica, salinitas, profil protein
1
I. PENDAHULUAN Salah satu habitat bakteria adalah akar tanaman atau rhizosfer dan bakteria yang hidup di daerah tersebut dinamakan rhizobakteria. Ada keterkaitan nutrisi yang unik antara tanaman dan rhizobakteria. Rhizosfer kaya akan eksudat yang dikeluarkan oleh tanaman yang tumbuh di atasnya. Senyawa eksudat tersebut antara lain mengandung karbohidrat, asam amino, asam organik, enzim dan senyawa-senyawa lain (Hoagland et al., 1985; Cheema et al., 2008) yang menjadi sumber nutrisi bagi rhizobakteria. Selanjutnya rhizobakteria akan mendekomposisi senyawa eksudat tersebut menjadi energi dan senyawa prekursor organik dan anorganik yang bermanfaat untuk rhizobakteria dan tanaman yang hidup di rhizosfer tersebut. Bashan dan Holguin (2002) menyatakan bahwa dalam lingkungan terestrial, kolonisasi rhizobakteria pada permukaan akar tanaman dapat memicu eksudasi akar. Keterkaitan ini menjadikan keberadaan rhizobakteria menjadi salah satu parameter produktivitas tanah (Kartasapoetra et al., 1991). Tanah yang subur dan dalam kondisi normal mengandung keanekaragaman rhizobakteria yang tinggi (Schlegel dan Schmidt, 1994). Kawasan mangrove di Pantai Wonorejo, Pantai Timur Surabaya merupakan salah satu habitat bagi rhizobakteria. Ketebalan mangrove Wonorejo mencapai 5-120 m dan menutupi 8,2 km dari 28,4 km garis pantai yang didominasi oleh spesies Avicennia marina (Hawatofat, 2006) dan Pluchea indica (pengamatan lapangan, 2008). Kedua spesies mengrove tersebut hidup dengan rentang salinitas yang berbeda. A. marina dominan di daerah dekat laut terbuka, sedang P. indica di daerah yang menjauhi laut menuju daratan. Adanya perbedaan dominasi tanaman dan salinitas menjadikan kawasan ini menarik untuk diamati keanekaragaman rhizobakterianya. Penelitian ini melakukan hal tersebut. Keanekaragaman rhizobakteria dikaji berdasarkan isolat yang berhasil dimurnikan dan karakter biokimianya mengikuti panduan dasar Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, the 9th Edition (Holt et al., 1994), juga dikaji berdasarkan profil protein yang disintesis oleh rhizobakteria tersebut. Data yang didapat akan menjadi database yang digunakan untuk penelitian lanjutan berkaitan dengan biodegradasi suatu senyawa.
2
II. METODOLOGI 2.1. Titik Sampling dan Pengambilan Sampel Ada 2 titik samping di pantai Wonorejo, Pantai Timur Surabaya yang berada di garis tegak lurus antara garis pantai ke arah darat sepanjang 2000m (Gambar 1). Berdasarkan pengukuran salinitas selama 3 hari berturutan, titik sampling adalah titik yang bersalinitas 15.33‰ dan 7.00‰. Kedua titik tersebut ditumbuhi tanaman A. marina dan P. indica. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada waktu surut. Sampel tanah diambil dari tanah rhizosfer yang berjarak 10cm dari pohon. Tanah diambil pada kedalaman 010cm (Wendling et al., 2005). Sampel tanah diambil secukupnya menggunakan spatula steril dan disimpan dalam botol film (Johnson, 1960 dalam Wedhastri, 2002). Tanah yang menempel pada akar, diambil dan dicampur rata (Meng et al., 2007).
2
1
Gambar 1. Titik sampling tanah rhizosfer A.marina dan P.indica di Pantai Wonorejo, Pantai Timur Surabaya : Titik 1 (15,33 ‰, A.marina dan P.indica) dan Titik 2 (7,00 ‰, A.marina dan P.indica).
2.2. Isolasi Rhizobakteria Sampel tanah diencerkan secara bertingkat
hingga diperoleh serial
pengenceran 10-1–10 -10. Dari masing-masing pengenceran, diambil 100µl dan ditanamkan ke permukaan medium padat Nutrient Agar (NA) bersalinitas 15.33‰ dan 7‰ dengan metode spread plate dan diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam. Salinitas diatur dengan penambahan NaCl. Setiap satu koloni rhizobakteria yang tumbuh kemudian dipindahkan ke medium baru yang sama dengan metode 16 streaks plate dan diinkubasikan kembali pada suhu 37 0C selama 24 jam. Pemindahan isolat dilakukan secara bertahap sampai diperoleh biakan murni sel rhizobakteria.
2.3. Uji Biokimia Isolat Rhizobakteria Isolat murni rhizobakteria kemudian diuji karakter biokimianya berdasarkan buku panduan dasar Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, the 9th Edition (Holt et al., 1994). Uji biokimia diadaptasikan dari metode Lay (1994), Cappucino 3
dan Sherman (2001), Harley dan Prescott (2002). Uji biokimia terdiri dari pewarnaan Gram dan endospora, kebutuhan oksigen, fermentasi karbohidrat, IMVIC (IndolMetyl Red-Voges Proskauer-Citrat), dan uji degdarasi protein (pembentukan hidrogen sulfida, urease, oksidase dan katalase). Isolat yang diuji adalah isolat yang berumur 24 jam.
2.4. Profil Protein Rhizomikrobia Dua puluh lima gram sampel tanah dari masing-masing titik dicampurkan secara aseptik kedalam Erlenmeyer yang berisi 400 ml medium NB steril, diinkubasikan di atas rotary shaker 110 rpm selama 1 minggu. Kultur pengayaan yang telah dihomogenkan dituang secara aseptis ke dalam tabung Falcon 50 ml sebanyak 37.5 ml dan disentrifuse 7000-7500 rpm selama 10 menit (Sudrajat et al., 2000). Supernatan dibuang dan pelet rhizobakteria dilisiskan dengan metode freeze & thawing sebanyak 3 kali secara berturut-turut. Satu ml sampel kemudian dipindahkan ke tabung mikro 1.5ml dan disentrifuse 13000 rpm selama 5 menit. Kemudian supernatan dicampur dengan bufer sampel (Tris, EDTA 2-Na, Gliserol, Bromofenol Brilian Blue, Β-mercapto etanol) dengan rasio v:v = 4:1 dan dipanaskan dalam air mendidih bersuhu 94C selama 4 menit. Sebanyak 25µl sampel dimasukkan ke dalam sumuran gel SDS-PAGE 12% dan dielekroforesis dengan arus listrik 120V selama 3-4 jam. Elektroforesisi dihentikan ketika warna biru menyentuh dasar gel. Gel dilepas dan direndam dalam pewarna Coomasie blue selama 24 jam pada kecepatan 100 rpm. Gel kemudian dicuci dengan larutan destainer (100 ml asam asetat glasial, 400 ml metanol, 500 ml akuades) selama 30 menit dan terakhir dengan larutan asam asetat 10 %. Standart marker adalah Prestained SDS PAGE (Biorad®, Jerman) yang mengandung protein miosin, b-galaktosidase, BSA (Bovine Serum Albumin), ovalbumin, karbonik anhidrase, soybean trypsin inhibitor, lisozim dan aprotinin dengan berat molekul (BM) secara berurutan adalah 206; 119; 97; 55; 38; 29; 18 dan 7 kDa. Pita protein sampel yang dianalisa adalah pita protein yang terlihat jelas dan muncul pada kedua ulangan, sedangkan protein yang smear diabaikan.
4
III. HASIL DAN PEMBAHASAN Dalam penelitian ini, jenis tanaman dan salinitas adalah faktor utama yang mempengaruhi keanekaragaman rhizobakteria. Jenis tanaman adalah A. marina dan P. indica yang mengsekresikan suatu eksudat tertentu ke rhizosfernya dan salinitas yang berpengaruh adalah 15.33‰, dan 7.00‰ (Gambar 2). Keanekaragaman rhizobakteria dilihat dari jenis isolat berdasarkan morfologi koloni, yaitu karakter bentuk, tepian, warna, elevasi dan permukaan koloni (Gambar 3a) dan karakter biokimia yang mengarah ke suatu genus tertentu (Tabel 1). Berdasarkan jumlah jenis isolat dan jumlah koloni, kemungkinan rhizobakteria di rhizosfer A. marina di dua titik salinitas adalah sama, yaitu ada sekitar 50 jenis rhizobakteria dengan jumlah total koloni sekitar 400 buah (Gambar 2). Ini menunjukkan bahwa rhizobakteria di rhizosfer A. marina adalah rhizobakteria yang tahan terhadap suatu kisaran salinitas. Ketahanan isolat tersebut mungkin berhubungan dengan karakter tanaman mangrove A. marina yang hidup pada salinitas tinggi (Valkenburg, 2008). Sedangkan rhizobakteria yang hidup di rhizosfer P. indica relatif kurang tahan terhadap kisaran salinitas tertentu, karena ada perbedaan jumlah jenis isolat dan jumlah total koloni di dua titik salinitas. Ketika isolasi dilakukan pada medium yang bersalinitas tinggi, maka terjadi penurunan jenis isolat rhizobakteria. Di salinitas 7.00‰ dapat ditemukan 24 jenis isolat, sedangkan di salinitas 15.33‰ hanya 6 jenis isolat (Gambar 2). Kerentanan terhadap kisaran salinitas ini mungkin sesuai dengan karakter tanaman P. indica yang merupakan tanaman peralihan yang lebih menyukai hidup di daratan yang tidak bersalinitas (Valkenburg, 2008). Dari Gambar 2 terlihat pula bahwa semakin sedikit jenis isolat rhizobakteria (6 jenis koloni di salinitas 15.33‰), maka semakin kecil kompetisi antar jenis rhizobakteria terhadap nutrisi dan ruang. Ini tampak dari jumlah total koloni di salinitas 15.33‰ sebanyak 230 koloni, sedangkan di salinitas 7.00‰ hanya sebanyak 89 koloni.
5
Gambar 2. Isolat rhizobakteria dari rhizosfer A.marina dan P. indica di dua salinitas 15.33‰, dan 7.00‰.
(a)
(b)
Gambar 3. (a) Keanekaragaman koloni rhizobakteria dan (b) genus Bacillus dari rhizosfer A. marina pada salinitas 7.00‰.
6
Ketika
dilakukan
pemurnian
koloni
rhizobakteri,
ternyata
tingkat
keberhasilannya sangat rendah: dari rhizosfer A. marina hanya sebesar 10-20% sedangkan dari rhizosfer P. indica adalah 50-60%. Misal dari rhizosfer A. marina bersalinitas 7.00‰ ditemukan 50 jenis morfologi koloni yang berbeda, tetapi hanya 5 isolat saja yang dapat dimurnikan (Gambar 2). Berdasarkan karakter biokimianya, kelima isolat tersebut cenderung masuk ke genus Bacillus dan Alteromonas (Tabel 1, Gambar 3b). Ini mungkin disebabkan karena pemurnian isolat dilakukan di medium buatan bersalinitas tanpa penambahan eksudat tanaman sintetis yang dibutuhkan oleh rhizobakteria. Menurut Nannipieri et al. (2008); Bashan dan Holguin (2002) keberadaan suatu eksudat yang disekresikan oleh tanaman ke rhizosfernya mempengaruhi pertumbuhan suatu rhizobakteria. Dari tingkat keberhasilan pemurnian seakan terlihat bahwa, eksudat akar yang dikeluarkan oleh A. marina lebih dibutuhkan oleh rhizobakteria yang hidup di rhizosfernya daripada rhizobakteria yang hidup di rhizosfer P. indica (Gambar 2). Eksudat akar A.marina antara lain adalah gula, asam amino, tanin, polifenol, glisin betain, asparagin, azadirakhtin, risin, stakyose (Ashihara et al., 1997) dan hidrokarbon berupa rantai panjang n-alkana, n-alkena dan alkana bercabang (Wannigama et al., 1981). Glisin betain disintesis A. marina untuk beradapatasi terhadap salinitas (Ashihara et al., 1997; Hibino et al., 2001; Suzukia et al., 2003). Sedangkan eksudat akar P. indica antara lain adalah sterol, terpen, glikosida (Roslida et al., 2008) dan flavonoid misalnya tanin (Dalimartha, 1999). Dari Gambar 2 dan Tabel 1 terlihat bahwa jenis tanaman dan salinitas mempengaruhi keberadaan suatu rhizobakteria. Di setiap titik sampling mempunyai komposisi rhizobakteria yang berbeda. Seperti contoh di rhizosfer A. marina bersalinitas 13.55‰ ditemukan genus Bacillus, Amphibacillus, Lampropedia, Acinetobacter dan Planococcus, sedangkan di rhizosfer P. indica bersalinitas 13.55‰ ditemukan genus Listeria, Klebsiella dan Brochothrix, atau di rhizosfer A. marina yang sama tetapi bersalinitas 7.00‰ ditemukan genus Bacillus dan Alteromonas. Genus yang ditemukan termasuk bakteri halotoleran yang mampu beradaptasi terhadap tekanan osmotik karena faktor salinitas. Untuk bertahan terhadap tekanan osmotik dari luar sel, bakteri halotoleran menggunakan molekul organik, seperti polyols dan turunannya, gula dan turunannya, asam amino dan turunannya, betain dan ektoin, serta molekul inorganik yang disintesis oleh bakteri tersebut atau ditranspor dari luar sel (Robbert, 2005). Sporosarcina telah dilaporkan dapat meningkatkan 7
konsentrasi ektoin bila terjadi peningkatan konsentrasi NaCl di luar sel. Demikian pula dengan Acinetobakter, Alteromonas dan Listeria yang meningkatan betain di dalam sel bila berada di lingkungan bersalinitas (Robbert, 2005). Hanya genus Bacillus yang terdeteksi di kedua jenis tanaman dan salinitas (Gambar 2). Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus adalah genus yang toleran terhadap suatu rentang salinitas tertentu. Loshon et al. (2006) melaporkan bahwa Bacillus dapat mengakumulasi glisin betain ketika hidup pada salinitas tertentu. Juga ternyata selain mampu mensintesis sendiri, B. subtilis juga dapat mengambil glisin betain atau turunan osmolit lainnya dari eksudat akar, hewan dan sel eukariot atau prokariot mati yang terdapat di tanah atau lingkungannya (Loshon et al., 2006).
8
Tabel 1. Karakter mikroskopis dan biokimia isolat rhizobakteria.
9
Sebagai data pendukung, terlihat bahwa protein yang diekstrak dari rhizobakteria di dua titik sampling juga menunjukkan perbedaan profil protein (Gambar 4). Di salinitas 15.33‰, terlihat bahwa rhizobakteria di rhizosfer A. marina dan P.indica selain mensintesis protein yang sama, juga mensintesis protein yang berbeda. Tanda panah merah menunjukkan pita protein yang berbeda tersebut. Selain ada/tidaknya pita protein, ketebalan pita protein juga relatif berbeda antara kedua rhiszosfer. Demikian pula dengan profil protein rhizobakteria dari kedua rhizosfer tanaman di salinitas 7.00‰. Sedangkan antar dua salinitas yang berbeda (15.33‰, dan 7.00‰) di rhizosfer yang sama, juga terdapat perbedaan profil protein. Misalnya berdasarkan berat molekulnya, protein yang disintesis oleh rhizobakteria di rhizosfer A. marina bersalinitas 15.33‰ lebih banyak jenisnya daripada di salinitas 7.00‰. Ini mungkin mengindikasikan bahwa pada cekaman salinitas yang lebih tinggi, rhizobakteria memerlukan lebih banyak protein untuk mencegah lisis sel. Lingkungan, seperti jenis rhizosfer dan salinitas, pada tingkat molekuler dapat mempengaruhi sintesis suatu protein menjadi lebih banyak atau sedikit (Yildiz, 2007). Rhizobakteria pada daerah bersalinitas beradaptasi dengan meningkatkan konsentrasi larutan dalam selnya melalui pemompaan ion dari lingkungan ke dalam sel (Blomberg dan Adler, 1992; Ramos, 2005), ekspresi suatu protein seperti osmotin (Zhu et al., 1995), enzim (Gong et al., 2001) dan larutan organik kompatibel (Nakamura, 1979 dalam El-shimy, 2007; Csonka dan Hanson, 1991; Galinski, 1995) agar tidak terjadi osmosis sel. Selain lingkungan, ekspresi protein juga tergantung pada spesies dan tahap pertumbuhannya (Hirano et al., 2004).
10
kDa
kDa
1A
1P
2A
2P
Gambar 4. Profil protein yang disintesis oleh rhizobakteria. Huruf A adalah rhizosfer A. marina, B adalah rhizosfer P. indica. Angka 1 menunjukkan salinitas 15.33‰ dan angka 2 adalah salinitas 7.00‰. Tanda panah merah menunjukkan perbedaan pita protein yang muncul di dua rhizosfer pada titik salinitas yang sama.
IV. KESIMPULAN -
Jenis tanaman dan salinitas mempengaruhi keanekaragaman rhizobakteria.
-
Di rhizosfer A. marina yang bersalinitas 15.33‰ mempunyai komposisi rhizobakteria yang lebih beragam dengan genus Bacillus, Amphibacillus, Lampropedia, Acinetobacter dan Planococcus, daripada yang bersalinitas 7.00‰ dengan genus Bacillus dan Alteromonas.
-
Di rhizosfer P. indica, rhizobakteria lebih beragam di salinitas 7.00‰ dengan genus Bacillus, Citrobacter, Edwardsiella, Sporosarcina, Listeria, Salmonella, Azotobacter dan Flavobacterium, daripada di salinitas 15.33‰ dengan genus Listeria, Klebsiella dan Brochothrix.
-
Profil protein menunjukkan ada perbedaan sintesis protein oleh rhizobakteria yang hidup di rhizosfer A. marina dan P.indica, serta di salinitas yang berbeda (15.33‰ dan 7.00‰).
TERIMA KASIH Terima kasih disampaikan kepada Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM Jogjakarta yang telah membantu analisa profil protein rhizobakteria di penelitian ini.
11
REFERENSI Ashihara, H., Adachi, K., Otawa, M., Yasumoto, E., Fukushima, Y., Kato, M., Sano, H., Sasamoto, H. dan Baba, S. 1997. “Compatible solutes and inorganic ions in the mangrove plant Avicennia marina and their effects on the activities of enzymes”. Zeitschrift fue r Naturforschung. 52c, 433–440 Bashan, Y. dan Holguin, G. 2002. “Plant Growth-Promoting Bacteria: a Potential Tool for Arid Mangrove Reforestation”. Trees 16:159-166. Blomberg A dan Adler L.1992. “Physiology of osmotolerance in fungi”. Advances in Microbial Physiology 33: 145–212. Cappuccino, J.G. dan Sherman, N. 2001. Microbiology A Laboratory Manual. San Fransisco : Benjamin Cummings. Cheema S. A., Khan, M.I., Tang, X., Zhang, C., Shen, C., Malik, Z., Shen, K., Chen, X. dan Chen, Y. 2008. “Enhancement of Phenanthrene and Pyrene Degradation in Rhizosphere of Tall Fescue (Festuca arundinacea)”. Journal of HazardousMaterial. doi:10.1016/j.jhazmat.2008.12.027 Csonka, L. N. dan Hanson, A.D. 1991. “Prokaryotic osmoregulation: genetics and physiology”. Annu. Rev. Microbiol. 45:569–606. Dalimartha, S.1999. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jilid 1. Trubus Agriwidya:Jakarta El-shimy, A., Alia, Ismail dan Gahiza, A. 2007. “Accumulation of Amino Acids in Anabaena Oryzae in Response to Sodium Chloride Salinity”. Journal of Applied Sciences Research, 3(3): 263-266. Department of botany, women's college, Ain shams university: Egypt. Galinski, E. A. 1995. “Osmoadaptation in bacteria”. Adv. Microbiol. Physiol. 37:273– 328 Gong, Z., Koiwa, H., Cushman, M.A., Ray, A., Bufford, D., Kore-Eda S., Matsumoto, T.K., Zhu, J., Cushman, J.C. dan Bressan, P.M. 2001. “Genes that are uniquely stress regulated in salt overly sensitive (sos) mutants”. Plant Physiol., 126: 363−375. Harley, J.P. dan Prescott, L.M. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology-Fifth Edition. The McGraw-Hill Companies. Hawatofat, F. 2006. “Struktur Komunitas Mangrove Di Daerah Wonorejo Pantai Timur Surabaya”. UNAIR: Surabaya Hibino, T., Meng, Y.-L., Kawamitsu, Y., Uehara, N., Matsuda, N., Tanaka, Y., Ishikawa, H., Baba, S., Takabe, T., Wada, K., Ishii, T. dan Takabe, T., 2001. “Molecular cloning and functional characterization of two kinds of betainealdehyde dehydrogenase in betaine accumulating mangrove Avicennia marina (Forsk.) Vierh”. Plant Molecular Biology 45, 353–363. Hirano, H., Islam, N. dan Kawasaki, H. 2004. “Technical aspects of functional proteomics in plants”. Phytochemistry, 65: 1487−1498. Hoagland, R. E dan Williams, R.D.1985.”The influence of secondary plant compounds on 377 the associations of soil microorganisms and plant roots. The chemistry of 378 allelopathy. Biochemical interactions among plants”. American Chemical Society, 379 Washington DC, 1985, pp. 301–325. 380 Holguin, G., Guzman, M.A., dan Bashan, Y. 1992. “Two New Nitrogen-fixing Bacteria from The Rhizosphere of Mangrove Trees: Their Isolation, Identification and in vitro Interaction with Rhizosphere Staphylococcus sp.” FEMS Microbiology Ecology. 101, 207-216.
12
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P., Staley, J. T.and Williams, S.T.. 1994. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. The 9th Edition. Williams and Wilkins Pub. USA. Kartasapoetra, A. G., Sutedjo, M. M. dan Sastroatmodjo, R. D. S.. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta: Jakarta Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Raja Grafindo Persada. Loshon, C.A., Wahome, P.G., Maciejewski, M.W. dan Setlow, P. 2006. “Levels of Glycine Betaine in Growing Cells and Spores of Bacillus Species and Lack of Effect of Glycine Betaine on Dormant Spore Resistance”. Journal of Bacteriology. p. 3153–3158 Vol. 188, No. 8. Meng, W., Jia-Kuan, C. dan Bo, L. 2007. ”Characterization of Bacterial Community Structure and Diversity in Rhizosphere Soils of Three Plants in Rapidly Changing Salt Marshes Using 16S rDNA”. Pedosphere 17(5): 545–556. Nannipieri, P. Ceccherini, M.T., Ascher, J. Landi L., Renella, G., Pietramellara, G. dan Valori F. 2008. ”Effects of Root Exudates in Microbial Diversity and Activity in Rhizosphere Soils”. Soil Biology 15. Ramos, J. 2005. “Introducing Debaryomyces hansenii, a salt-loving yeast. In:, Adaptation to Life at High Salt Concentrations in Archea, Bacteria and Eukarya (Gunde-Cimerman N, Oren A, Plemenitaš A, eds)”. Springer, the Netherlands:441–451. Robert, M.F. 2005. “Organic Compatible Solutes of Halotolerant and Halophilic Microorganisms”. Saline Systems 1:5. Roslida, A., Erazuliana, A.K. dan Zuraini, A.2008. “Anti-Inflammatory And Antinociceptive Activities Of The Ethanolic Extract Of Pluchea Indica (L) Less Leaf”. Pharmacologyonline 2: 349-360: Malaysia Schlegel, H. G. dan Schmidt, K. 1994. Mikrobiologi Umum edisi keenam. Terjemahan Tedjo Baskoro: Allgemeine Mikrobiologie 6. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Sudrajat, D., Lina, M. R. dan Suhadi, F. 2000. Deteksi Cepat Bakteri Escherichia coli Enterohemoragik (Ehek) dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Risafah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Teknologi ISOlop dan RadiaSl. Puslitbang teknologi isotop dan radiasi,Batan: Jakarta Suzukia, M, Yasumotoa, E., Babab, S. dan Ashiharaa, H.2003. “Effect of salt stress on the metabolism of ethanolamine and choline in leaves of the betaine-producing mangrove species Avicennia marina”. Phytochemistry 64 (2003) 941–948; Ochanomizu University, Bunkyo-ku: Tokyo, Japan. Valkenburg, J.L.C.H. dan N. Bunyapraphatsara. 2008. ”Detil data Pluchea indica Less”. Medicinal and poisonous plants 2 p.441-443.
diakses pada tanggal 17 Okt 2008. Wannigama, G.P., , Volkman, J. K., Gillan, F. T., Nichols, P.D. dan Johns, R.B. 1981. “A comparison of lipid components of the fresh and dead Leaves and pneumatophores of the Mangrove Avicennia marina”. Phytochemistry, Vol. 20, No. 4, pp. 659-666,. 0031-9422/81/040659--08 $02.00/0. Department of Organic Chemistry, University of Melbourne,. Pergamon Press Ltd.: Great Britain, Australia. Wedhastri, S. 2002. “Isolasi dan Seleksi Azotobacter spp. Penghasil Faktor Tumbuh dan Penambat Nitrogen dari Tanah Asam”. Jurnal Ilmu Tanah dan Lingkungan Vol 3 (1) pp 45-51.
13
Wendling, L.A., Harsh, J.B., Ward, T.E., Palmer, C.D., Hamilton, M.A., Boyle, J.S. dan Flury, M. 2005. “Cesium Desorption from Illite as Affected by Exudates from Rhizosphere Bacteria”. Environmental Science Technology, 39, 4505-4512. Yıld z, M. 2007. “Two-dimensional electrophoretic analysis of soluble leaf proteins of a salt-sensitive (Triticum aestivum) and a salt-tolerant (Triticum durum) cultivar in response to NaCl stress. J. Integr. Plant Biol., 49: 975-981. Zhu, B., Chen, T.H. dan Li P.H.1995. “Expression of three osmotin-like protein genes in response to osmotic stress and fungal infection in potato”. Plant Mol. Biol., 28: 17−26.
14
