MASARYKOVA UNIVERZITA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

NÁVRH A PŘÍPRAVA BIOSENZORU PRO DETEKCI TVORBY BIOFILMU Diplomová práce

Martin Jakubec

Vedoucí práce: doc. MUDr. Filip Růžička, Ph.D.

Brno 2013

Bibliografický záznam Autor:

Bc. et Bc. Martin Jakubec Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Návrh a příprava biosenzoru pro detekci tvorby biofilmu

Studijní program:

Biologie

Studijní obor:

Speciální biologie

Vedoucí práce:

doc. MUDr. Filip Růžička, Ph.D.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

80

Klíčová slova:

biofilm, impedanční spektroskopie, biosenzor, Staphylococcus epidermidis

Bibliographic Entry Author:

Bc. et Bc. Martin Jakubec Faculty of Science, Masaryk University Department of experimental biology

Title of Thesis:

Design and preparation of the biosensor for the detection of biofilm formation

Degree programme:

Master’s degree

Field of Study:

Biology

Supervisor:

doc. MUDr. Filip Růžička, Ph.D.

Academic Year:

2012/2013

Number of Pages:

80

Keywords:

biofilm, impedance spectroscopy, biosensor, Staphylococcus epidermidis

Abstrakt Mikroorganismy se mohou vyskytovat v planktonickém nebo přisedlém stavu, ve kterém prostřednictvím produkce extracelulárních polymerů (EPS) formují komplikovanou prostorovou strukturu označovanou jako biofilm. Měření tvorby biofilmu pomocí impedance se jeví jako vhodný způsob analýzy, ale doposud nebyla popsána přesná metodika detekce biofilmu a nebylo provedeno srovnání impedančních spekter většího množství biofilm pozitivních a biofilm negativních kmenů. Cílem této práce bylo vytvoření biosenzoru pro detekci biofilmu a vyřešení souvisejících problémů: ověření vlivu tvaru a vzdálenosti elektrod senzoru pro detekci biofilmu, stanovení parametrů měření pomocí impedance a nalezení vhodné statistické metody pro detekci růstu biofilmu. V praktické části diplomové práce byla vyzkoušena impedanční spektroskopie jako modelová metoda odlišení biofilm pozitivních a negativních kmenů Staphylococcus epidermidis, které byly takto rozlišeny v předchozí studii na základě přítomnosti nebo absence ica lokusu. Bylo vyrobeno několik vzorků elektrod a byl popsán vliv tvaru zvolených elektrod na měření impedance v roztoku bakterií a byl navržen model pro statistického vyhodnocení přítomnosti biofilmu.

Abstract Microorganisms may be present in planktonic or sessile state in which they can form a complex spatial structure known as biofilm through the production of extracellular polymeric substances (EPS). Measurement of biofilm formation using impedance seems to be an appropriate method of analysis, but accurate detection methods of biofilm have not been describe yet and comparation of lager collection of impedance spectra of biofilm positive and biofilm negative strains were not performed. The aim of this work was to design of biosensor for biofilm detection and solving of related problems: experimental verification of the influence of shape and distance of the sensor electrodes for biofilms detection, adjusting of measurement parameters of impedance and finding appropriate statistical methods for the detection of growth biofilmu. In practical part of the thesis the impedance spectroscopy was used as a method for distinguish of biofilm positive and negative strains of Staphylococcus epidermidis, which have been differentiated previously on the basis of the presence or absence ica locus. Several samples of experimental electrodes were produced and the influence of the shape of selected electrodes to ability of impedance measure in a solution of bacteria was described and statistical model for evaluation of the presence of biofilm was designed.

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat svému vedoucímu diplomové práce doc. MUDr. Filipu Růžičkovi, Ph.D. za odborné vedení a rád bych se omluvil za komplikace způsobené zdlouhavou výrobou přístroje a elektrod. Dále bych chtěl poděkovat odborným konzultantům, kterým jsou MSc Robert Kadlec a Ing. Pavel Křepelka. Také děkuji milému kolegovi Jiřímu Sližovi za výbornou spolupráci. V neposlední řadě děkuji přítelkyni Ivetě Ohnheisrové ze trpělivost a laskavost.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně s využitím zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 12. května 2013

……………………………… Martin Jakubec

1 Obsah

2 Seznam zkratek ........................................................................................................................ 10 3 Úvod ......................................................................................................................................... 11 4 Teoretická část ......................................................................................................................... 13 4.1. Fyzikální popis adherence ................................................................................................ 14 4.2 Biologický proces adherence ............................................................................................ 17 4.3 Růst biofilmu a produkce EPS .......................................................................................... 20 4.4 Specifika biofilmu stafylokoků ......................................................................................... 24 4.4.1 ica–dependentní biofilm ............................................................................................ 24 4.4.2 ica-nezávislý biofilm.................................................................................................. 25 4.5 Metody kultivace biofilmů ................................................................................................ 26 4.5.1 Metody statické kultivace biofilmů ............................................................................ 26 4.5.2 Metody dynamické kultivace biofilmu ...................................................................... 28 4.6 Metody detekce biofilmu .................................................................................................. 30 4.6.1 Barvení biofilmu ........................................................................................................ 30 4.6.2 Metoda detekce pomocí kultivace na kongo červeň agaru......................................... 31 4.6.3 Skenovací laserová konfokální mikroskopie (CLSM) ............................................... 31 4.6.4 Kapilární elektromigrační techniky ............................................................................ 32 4.7 Biosenzor .......................................................................................................................... 33 4.7.1 Biorekogniční složky biosenzoru ............................................................................... 34 4.7.2 Fyzikálně-chemické převodníky biosenzorů .............................................................. 34 4.8 Impedanční spektroskopie ................................................................................................. 36 4.9 Impedanční mikrobiologie ................................................................................................ 38 5 Praktická část ........................................................................................................................... 44 5.1 Cíle diplomové práce......................................................................................................... 44 5.2 Materiál a Metodika.......................................................................................................... 45 5.2.1 Seznam přístrojů ........................................................................................................ 45 5.2.2 Seznam chemikálií a médií ........................................................................................ 45 5.2.3 Bakteriální kmeny a kultivace .................................................................................... 45 5.2.4 Příprava a modifikace elektrod .................................................................................. 46 8

5.2.5 Měření impedance ..................................................................................................... 48 5.2.6 Statistické vyhodnocení ............................................................................................. 50 5.3 Výsledky a vyhodnocení ................................................................................................... 51 5.3.1 Pokus s makroelektrodami – Fáze I ........................................................................... 51 5.3.2 Vyhodnocení kultivace 40 kmenů S. epidermidis na E-plate – Fáze II ....................... 58 6 Diskuze..................................................................................................................................... 65 7 Závěr ........................................................................................................................................ 68 8 Dedikace................................................................................................................................... 68 9 Reference ................................................................................................................................. 69 10 Přílohy .................................................................................................................................... 79

9

2 Seznam zkratek Aap – autoaggregation protein; samoagregační protein Bap – biofilm associated protein; protein spojený s tvorbou biofilmu bhp – cell wall associated biofilm protein CbsA – collagen-binding S-layer; S-vrstva vázající kolagen CLSM – confocal laser scanning microscopy; skenovací laserová konfokální mikroskopie Cna - collagen-binding proteins; kolagen vázající proteiny CNS – koaguláza negativní stafylokoky CV – cyklická voltametrie EbpS- elastin binding protein, elastin vázající protein ECM – extracelulární matrix eDNA – extracelulární DNA EhaB – autotransportér Escherichia coli typ B EPS – extracelulární polymery FBP - fibrinonectin binding proteins; adheziny vázající fibrinonectin ica lokus – intercellular adhesion locus; lokus mezibuněčné adheze IDA – interdigitated array electrode; tištené matice elektrod IS – impedanční spektroskopie MSCRAMM - microbial surface components recognizing adhesive matrix biomolecules PCA-DA – principal component analysis – discriminant analysis; analýza hlavních komponent a diskriminantní analýza PIA - polysaccharide intercellular adhesin; poly N-β(1,6)-acetylglukosamin PLS – partial least square SNV – standard normal variate SRRP – serine-rich repeat proteins; proteiny obsahující velké množství opakovaní serinů

10

3 Úvod Biofilm

je

mikrobiální

organizovaná

struktura,

která

umožňuje

proliferaci

mikroorganizmů v místech a za podmínek, ve kterých by se volné planktonické bakterie nemohly dlouhodobě udržet ani přežít. Bakterie jsou v něm chráněny v extrapolymerní matrix před působením např. antibiotik nebo před imunitní odpovědí hostitele. Od svého objevu bylo zjištěno, že biofilm může být za vhodných podmínek tvořen velmi rozsáhlou paletou mikroorganizmů (Costerton et al., 1995, Hall-Stoodley et al., 2004). Někdy je tvorba biofilmu podmíněna přítomností stresu, například nedostatkem živin, přítomností velké koncentrace metabolitů nebo jiných látek. Dalším příkladem podmínek, které mají výrazný vliv na formování biofilmu jsou vlastnosti povrchu, které velmi výrazně ovlivňují vlastní adherenci mikroorganizmů. V neposlední řadě je velmi důležitá produkce extracelulárních polymeru, které slouží jako kostra pro vazbu dalších proteinů, polysacharidů, DNA a glykoproteinů. Jedním z klinicky významných případů, kde tvorba biofilmu je sledovanou patogenní vlastností, je schopnost druhu Staphylococcus epidermidis kolonizovat intravenózní katetry a další implantáty. U tohoto druhu byl identifikován jako jeden ze základních biofilmových proteinů β-1,6-N-acetylglukósamin (PIA - polysaccharide intercellular adhesin), který byl objeven také např. u Staphylococcus aureus (Costa et al., 2009). Metody identifikace biofilm tvořících kmenů jsou pracné a získané výsledky se mohou výrazně lišit dle použitých kultivačních podmínek (Alavi et al., 2012). Chování daného kmene v laboratorních podmínkách nemusí odpovídat jeho chování v přirozeném prostředí a při zavádění metodiky je nutné vyzkoušet celou paletu kultivačních podmínek, aby měřené výsledky byly dostatečně reprezentativní. Cílem této práce bylo experimentální ověření vlivu tvaru a vzdálenosti elektrod senzoru pro detekci biofilmu, stanovení parametrů měření pomocí impedance a nalezení vhodné metody detekce. Potenciální sensor a biosenzor měřící impedanci během kultivace může být využit pro rychlé stanovení schopnosti mikroorganizmů tvořit biofilm za daných kultivačních podmínek a relativně jednoduché zapojení umožňuje provádět a vyhodnocovat mnoho vzorků současně. V praktické části diplomové práce byla vyzkoušena impedanční spektroskopie jako modelová metoda odlišení biofilm pozitivních a negativních kmenů Staphylococcus epidermidis, které byly takto rozlišeny v předchozí studii na základě přítomnosti nebo absence ica lokusu (Ruzicka et al., 2004). Praktická část byla rozdělena na dvě fáze. V první fázi byla snímána impedanční charakteristika u deseti kmenů během kultivace na 11. typech experimentálních elektrod, které se 11

mezi sebou lišili tvarem a vzdáleností vlastních elektrod. Ve druhé fázi byla na měření použita mikrotitrační destička E-plate, která je součástí xCelligence systému od Roche. Na dně každé jamky mikrotitrační destičky je hustá síť prstových elektrod, pomocí kterých lze snímat i velmi malé změny v impedanci na dně jamky. V této druhé fázi bylo pro ověření použito již 40 kmenů stafylokoků.

12

4 Teoretická část Bakterie, ale např. i kvasinky se mohou vyskytovat v planktonického nebo přisedlém stavu, ve kterém prostřednictvím produkce extracelulárních polymerů (EPS) formují komplikovanou prostorovou strukturu označovanou jako biofilm (Molobela and Ilunga, 2012). Bakterie v této struktuře se vyznačují určitým stupněm vnitro a mezidruhové komunikace pomocí biochemických signálů tzv. quorum sensing a určitým stupněm vzájemné spolupráce. Produkce EPS zajišťuje do značné míry jak mechanickou, tak ochranu před chemickými dezinfektanty, antimikrobiální terapií a ochranu před hostitelskou imunitní odpovědí (Hoiby et al., 2010). Bylo objeveno, že právě formování biofilmu a následná rezistence bakteriální komunity antimikrobiálním látkám je příčinou mnohých chronických bakteriálních infekci (Costerton et al., 1999). Nezanedbatelným mechanismem resistence je také velmi snadný přenos genů mezi jednotlivými bakteriemi, který je umožněn kromě aktivní konjugace také vysokou koncentrací volné DNA v biofilmu. Existuje několik definic biofilmu. Nejstarší definice biofilmu je od Costertona et al. (Costerton et al., 1995), který biofilm popisuje jako „strukturalizovanou komunitu bakteriálních buněk v ochranném polymerním matrixu produkovaným vlastními buňkami, které jsou adherované na inertním nebo živém povrchu“. Elder et al., (Elder et al., 1995) popsal biofilm jako „funkční konsorcium mikroorganizmů organizovaných v rozsáhlém polymerním matrixu“. Zatímco Carpentier a Cerf (Carpentier and Cerf, 1993) zjednodušil definici na: „komunitu mikroorganizmů zakotvených v organické polymerní síti adherované na povrch“. Při velkém zjednodušení je zřejmé, že v biofilmu se vyskytují tři základní ingredience: mikrob, EPS a povrch. Při odstranění jakékoli této komponenty se biofilm nevyvine. Výjimku tvoří planktonické biofilmy, kde ale lze definovat povrch jako vlastní bakterie. Proces formování biofilmu je komplexní a velmi záleží na typu mikroorganismu, charakteru povrchu nebo vlivu fyzikálních podmínek prostředí. Typickým příkladem je biofilm vyvíjející se na rozhraní kapaliny a plynu za působení vysokých smykových sil. Takový biofilm je typicky méně robustný, ale velmi pevně adherovaný na pevný povrch substrátu v kapalině. Biofilm se vyskytuje ve velmi různorodém prostředí a může se tvořit se například na zubech lidí i zvířat, na kořenech rostlin, trupech lodí, v odpadových systémech a na průmyslových produktovodech (Molobela and Ilunga, 2012). Toto je pouze malý zlomek situací, kde je možné pozorovat biofilm. Biofilmy je možné z hlediska člověka velmi hrubě rozdělit na škodlivé a prospěšné. Mezi nejvýraznější zástupce škodlivých biofilmů patří biofilmy vyskytující se v lidském těle, na poškozených srdečních chlopních, implantátech nebo katetrech. Mezi prospěšné biofilmy patří například biofilm na kořenových systémech rostlin, biofilmy využívané

13

v čistících stanicích odpadních vod, biofilmové remediační disky, biofilmová probiotika ale i benefitní biofilmy gastrointestinálního a urogenitálního traktu. Základní krok formování biofilmu je primární adherence planktonických bakterií na povrch substrátu a jejich udržení po dostatečně dlouhou dobu, než mikrobiální buňky začnou produkovat biologickou složku nutnou pro jejich trvalou adherenci. Tento krok je také jeden z nejlépe prostudovaných, vzhledem k lákavé možnosti zastavit formování biofilmu již v raných fázích a relativně snadnému zabránění následné bakteriální persistence.

4.1. Fyzikální popis adherence Pro primární adherenci je nutné, aby se mikroorganismus dostal do kritické vzdálenosti od povrchu typicky méně než 1 µm (Marshall, 1992, Carpentier and Cerf, 1993). Do této vzdálenosti se bakterie dostane buď náhodně, například pomocí proudu kapaliny, nebo cíleně pomocí motility nebo chemotaxe. Následně je výsledek primární adheze závislý na součtu přitažlivých a odpudivých sil, mezi které patří: (i) hydrofobní interakce, (ii) elektrostatické interakce, (iii) sterické síly, (iv) van der Waalsovi síly a (v) hydrodynamické síly. Z nichž první dvě zmíněné mají největší vliv na výsledek adheze (Carpentier and Cerf, 1993). Velmi silné elektrostatické interakce vedou spíše k odpuzování, protože většina bakterií a inertních povrchů jsou záporně nabité. Prakticky jedinou doposud známou výjimkou je Stenotrophomonas maltophilia, která je i při fyziologickém pH kladně nabitá a tento náboj je hlavním mechanismem její adherence na kladně nabité povrchy jako je sklo, teflon nebo materiály využívané pro výrobu implantátů (Jucker et al., 1996). Fyzikální průběh adherence byl v minulosti velmi intenzivně zkoumán a byly prezentovány určité teorie, které umožnují odhadnout pravděpodobnost adherence daného mikroba na povrch určeného substrátu. S dalším rozvojem značení a vizualizace, například specifickým značením polárního bičíku nebo pilů, bylo umožněno přímé pozorování adherence. Také jsou vytvořeny počítačové modely, které zohledňují mnoho proměnných najednou a simulují adherenci a tvorbu biofilmu zkoumaného kmene (Shen et al., 2012). DVLO teorie Fyzikální průběh adherence může být popsán pomocí modelu chování koloidních částic v roztoku tzv. DVLO teorie (Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek) (Carpentier and Cerf, 1993, Verwey, 1947).

Klasická DVLO teorie popisuje výpočet Lifshitz-van der Waalsových a

Coulombických elektrostatických interakcí. Lifshitz-van der Waalsovi síly působí na velmi malé vzdálenosti, mezi makroskopickými objekty (bakteriemi) a jsou vždy přitažlivé. Jedná se o slabou sílu mezi dvěma neutrálně nabitými objekty. Coulombické elektrostatické interakce působí na větší vzdálenosti a mohou být přitažlivé nebo odpudivé. 14

Později byla tato teorie vylepšena zahrnutím interakcí kyselin a bází a zahrnutím schopností donace nebo příjmu elektronu (Van Oss et al., 1986). Tato vylepšená teorie lépe odpovídá fyziologickému prostředí, protože zahrnuje i vliv nábojů na povrchu bakterie a substrátu a jejich vzájemnou interakci. Pro popis adheze mikrobů pomocí této teorie stačí tedy znát sumu van der Waalsových, elektrostatických interakcí a interakcí mezi kyselinou a bází u povrchů mezi bakterií a substrátu, které se k sobě přibližují. Gcelková = GLW + GEL + GAB

(1)

kde: Gcelková = celková energie adheze GLW = van der Waalsova energie GES = energie elektrostatických interakcí GAB = acidobazická interakce Výpočet těchto sil závisí na geometrickém tvaru interagující částice. Mezi nejčastější patří kruhovité tvary a rovnice popisující jejich výpočet lze nalézt ve výše uvedených publikacích. Pro výpočet síly adherence pomocí této teorie je nutné znát molekulární vlastnosti adherující částice vyjádřené Hamakarovou konstantou. Tato hodnota charakterizuje intenzitu interakcí dvou povrchů v kapalném prostředí a závisí na jejich dielektrických vlastnostech. Hamakarova konstanta může být vypočítána pro inertní koloidní částice, ale ne pro živé bakterie. Nicméně byly vyvinuty dvě metody odhadu Hamakarovi konstanty i pro živé mikroorganizmy. Prvním je mikroskopický přístup, kde se předpokládá podobné chování bakterií jako mezi párem atomů. Druhý přístup, makroskopický, zjednodušuje částice a médium na kontinuální fázi (Van Oss et al., 1986, van Oss et al., 1987). Tento odhad umožní určitou míru schopnosti určení síly adherence mezi zkoumaným mikrobem a substrátem za daných stálých podmínek. Termodynamický přístup Další teorie popisující adherenci je založena na povrchové termodynamice tzv. termodynamickém přístupu. Tato teorie předpokládá, že k adherenci dochází, jen pokud je celková volná energie systému negativní. Tedy v případě bakteriální adheze na pevný substrát musí být energetický stav systému bakterie-pevná látka nižší než bakterie a pevný substrát v odděleném stavu. ∆Gadh = γbs – γbl - γsl

(2)

kde Gadh je změna Gibbsovy volné energie při adhezi částice a γ představuje mezifázovou volnou energii mezi bakterií-substrátem (γbs), bakterií- kapalinou (γbl) a substrátem- kapalinou (γsl).

15

Obrázek č. 1: Ilustrace adheze buňky bakterie (B) na substrát (N) v roztoku (V). γ představuje energii v jednotlivých rozhraní fáze (převzato z (Procházková et al., 2011)) Experimentální zjištění volné energie je založeno na měření kontaktního úhlu kapky a následného výpočtu podle několika různých přístupů (Bellon-Fontaine et al., 1990). Je měřen kontaktní úhel kapky destilované vody na očištěném substrátu a na substrátu pokrytém vrstvou mikroorganizmů. Z tohoto je následně vypočtena energie fázového rozhraní pro rozhraní substrát/vodný roztok a substrát/bakterie. Při znalosti fázového rozhraní je možné zjistit uvolněnou volnou energii během adherence. Termodynamický přístup tedy využívá složky mezifázových napětí vypočítaných z kontaktního úhlu kapalin (Procházková et al., 2011). To znamená, že vypočítaná volná Gibbsova interakční energie v sobě zahrnuje pouze příspěvek van der Waalsových a acidobazických interakcí. Není zde zahrnut vliv elektrostatických interakcí mezi bakteriemi a substrátem a bakteriemi navzájem. Hydrofobicita mikroorganizmů a její vliv na adherenci Jak již bylo zmíněno výše hydrofobicita je jednou ze silnějších sil, která přispívá k primární adhezi a proto je tato vlastnost také jedním z ukazatelů interakce bakterií a povrchů. Mezi metody, které tyto interakce zkoumají, patří například test bakteriální adherence na uhlovodíky, hydrofobní chromatografie, test agregace se siřičitanem amonným a testy rozpustnosti v různých organických solventech. Bohužel většina metod je reprodukovatelná pouze při velmi vysokých hodnotách hydrofobicity nebo hydrofility použitého bakteriálního kmene (Mozes and Rouxhet, 1987).

16

Studie vlivu hydrofobicity na adherenci u S. epidermidis a koaguláza negativních stafylokoků (CNS) jsou bohužel nejednotné se smíšenými výsledky. Některé studie pozorují zvýšenou adherenci na hydrofobní povrchy (Wang et al., 1993, Herrmann et al., 1988), zatímco jiné naopak pozorují zvýšenou adherenci na hydrofilní povrchy (Dunne and Burd, 1993). Velkou roli v rozdílných výsledcích hraje i rozdílný přístup k úpravě povrchu substrátu před experimentem. U některých experimentů je zvolen nevhodný postup čištění, který může vést ke změně hydrofobity substrátu. Přesný proces detekce hydrofobity mikroorganizmů ještě není stanoven.

4.2 Biologický proces adherence Pevné a nezvratné přichycení bakterie na substrát je možné díky produkci rozsáhlého arzenálu molekul označovaných jako adheziny (Henderson et al., 2011). Tyto proteiny jsou součástí biologického procesu adherence, který je nezbytný pro nezvratnou adherenci bakterie na substrát a následnou tvorbu biofilmu. Mezi tyto biologické kotvy patří i proteiny, které vážou eukaryotické adhezivní molekuly – fibrinonectiny (Pankov and Yamada, 2002). Fibrinonectiny jsou součástí mezibuněčného prostoru vícebuněčných organizmů známé jako extracelulární matrix (ECM). Tento matrix je zjednodušeně směs fibrilárních proteinů a proteoglykanů, které mají za úkol chránit a propojovat tkáně o různých funkcí (Patti et al., 1994). Mnoho složek ECM je právě cílem adhezinů produkovaných bakteriemi – souhrnně občas označovanými jako MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix biomolecules) a mnohokrát je právě jejich produkce jedním z virulentních faktorů klinicky významných kmenů (Chagnot et al., 2012). Adheziny vázající fibrinonectin Fibrinonectiny jsou velké glykoproteiny vyskytující se v tělních tekutinách, na povrchu buněk a v jíž dříve zmiňovaném extracelulárním matrixu, adheziny jej jsou velmi častou známkou patogenity daného kmene a jsou často ukazatelem jeho schopnosti adherovat a proliferovat v lidském těle. Jejich funkce je spojovat intracelulární cytoskeleton s vnějším ECM ve kterém buňka existuje. Také se začínají vyskytovat důkazy o signálních funkcích fibrinonectinu a jeho proteolických produktech. Je tedy možné, že také bakteriální adheziny vázající fibrinonectin mají (FBP) mají jinou roli než pouhou adhezi (Sandig et al., 2009). Jako první byla vazba bakterie na fibrinonectin pozorována u S. aureus. Streptokoci byl další rod, u kterého byla tato vazba pozorována a dnes je již identifikováno více než 100 různých bakteriálních FBP vyskytujících se u několika různých druhů (Henderson et al., 2011, SchwarzLinek et al., 2006).

17

U gram-pozitivních bakterií patří FBP mezi členy již výše zmíněné MSCRAMM rodiny. Tato rodina má společné určité strukturní znaky proteinů. Tím je konkrétně: (i) N-konec obsahuje signální sekvenci pro sekreci skrze bakteriální stěnu; (ii) vazebná oblast na fibrinonectin je v centru proteinu; (iii) C-konec obsahující transmembránový motiv LPXTG, který je rozeznáván enzymem sortázou a kovalentně se váže na buněčnou stěnu peptidoglykanu (Henderson et al., 2011). U mnohých FBP byla, ale pozorována také značná odchylka od tohoto klasického vzoru (Henderson et al., 2011). S. aureus nese tandemově geny pro dva typy FBP onačené jako FBPa a FBPb (Jonsson et al., 1991). Většina klinicky izolovaných kmenů nese alespoň jeden z těchto dvou genů (Nashev et al., 2004). Jedná se o velké proteiny dělené na oblast A zahrnující první polovinu proteinu od N-konce, následující oblast obsahující několik krátkých opakování (40 párů bází) a C-konec obsahující kotvicí motiv LPXTG (Signas et al., 1989). Oblast A je sekvenčně velmi odlišná u FBPa a FBPb. Dokonce v případě FBPa je známo sedm alelických variant tohoto genu, které jsou sekvenčně odlišné a tedy i různě antigenní (Loughman et al., 2008). Vazba FBP na fibrinonectin umožňuje nejenom pevnou adhezi S. aureus na ECM, ale také umožňuje jeho přichycení na celou řadu dalších biologických povrchů, jako jsou například buňky endotelu, epitelu, fibroblastů nebo osteoblastů (Peacock et al., 1999, Schroder et al., 2006, Lindahl et al., 1990, Mongodin et al., 2002, Williams et al., 2002). S. aureus se také může projevit jako intracelulární patogen, kdy se dostává do cytoplazmy nefagocytujících buněk endotelu, epitelu, keratinocytů nebo osteoblastů (Lowy et al., 1988, Almeida et al., 1996, Nuzzo et al., 2000, Hudson et al., 1995). Invaze do cytoplazmy je uskutečněna právě pomocí fibrinonectinového můstku mezi FBP na povrchu bakterie a mezi buněčným integrinem α5β1. (Ahmed et al., 2001, Fowler et al., 2000). V intracelulárním prostoru je bakterie chráněna před působením antibiotik i před imunitní odpovědí hostitele. FBP jsou ale také využívány imunitním systém v boji proti infekci S. aureus. Příkladem je exprese receptoru α5β1 aktivovanými zánětlivými makrofágy a díky tomu výšená schopnost pohlcení a strávení bakterie (Shinji et al., 1998, Shinji et al., 2007). Kromě FBPa a FBPb nese S. aureus mnoho další fibrinonectin vázajících adhezinů a všechny se určitým způsobem podílejí na adherenci buňky na ECM. Bylo ale dokázáno, že delece těchto dvou kmenů má velmi výrazný vliv na schopnost kmene osidlovat tkáň (Henderson et al., 2011, Brouillette et al., 2003). Kolagen, Laminin a Elastin vázající adheziny Stejně jako fibrinonectin jsou kolagen, laminin i elastin další složky lidského těla, které mohou představovat vhodnou složku pro zakotvení adherujících bakterií. Existuje 28 různých typů kolagenu značených I až XXVIII, které tvoři strukturu ECM. Nejčastěji se ovšem setkáváme s kolageny typu I až V, které jsou základní stavební složkou rozmanitých makromolekulárních 18

struktur (Ricard-Blum, 2011). Kolagen vázající proteiny, značené jako Cna – kolagen adheziny, byly poprvé identifikovány u kmene S. aureus. Analogy Cna byly následně nalezeny u mnoha jiných bakteriálních kmenů a byla pozorována také jejich různě silná vazba na kolagen různých typů. Příkladem je například kolagen vázající S-vrstva Lactobacillus spp. (CbsA) (Nallapareddy et al., 2003, Pietrocola et al., 2007). Laminin je vysoce síťující činidlo, které je tvořeno vazbou vždy tří různých podjednotek α, β a γ, které jsou spojeny disulfidickou vazbou (Durbeej, 2010). Na rozdíl od kolagenu a fibrinonectinu není registrována žádná doména vázající pouze laminin. Nicméně několik laminin adhezinů je již známo. Příkladem je CbsA objevený u Lactobacillus spp., který je schopen vázat také laminin (Antikainen et al., 2002) nebo autotransportér enterohemorrhagické Escherichia coli – EhaB (Wells et al., 2009). Elastin je složen s monomerních prekurzorů – tropoelastinu, který obsahuje střídající se hydrofobní a cross-linkovou oblast (Muiznieks et al., 2010). Stejně jako u lamininu nebyla oblast adhezinů vázající tuto složku ECM ještě moc prozkoumána. Byl popsán pouze jeden membránový protein S. aureus vázající elastin – EbpS, který obsahuje vazebný motiv TNSHQD (Park et al., 1999). Kromě toho byla ještě pozorována schopnost již výše zmíněného FBPa částečně vázat také i elastin (Keane et al., 2007). Glykosylované proteiny Další rodinu nespecifických adhezinů tvoří glykosylované proteiny, které jsou schopny se vázat na široké rozmezí povrchů (Zhou and Wu, 2009). Tyto proteiny jsou specifické velkým obsahem repetice serinů ve své struktuře a hrají hlavní roli v patogenezi u nejčastějšího biofilmu vůbec – u zubního kazu (Lizcano et al., 2012). Glykosylované proteiny slouží jako další velmi významný a velmi dobře prozkoumaný adhezin vyskytující se hlavně u gram-pozitivních ústních streptokoků (Zhou and Wu, 2009). Tyto proteiny obsahují velké množství serinových opakování (SRRP). SRRP je tvořen dvěma regiony obsahující serinové opakování a jedním nebo dvěma druhově specifickými regiony (Takamatsu et al., 2006). Druhově specifické regiony (NR domény) se vyskytují hlavně u N-konce, který zprostředkovává adhezi a u C-konce, který je zakotven v buněčné stěně. NR domény jsou velmi variabilní, ale všechny se vykazují určitým stupněm afinity ke keratinu nebo kyselině sialové (Zhou and Wu, 2009). Domény jednotlivých druhů se liší jak v sekvencích, tak ve velikosti pohybující se mezi 129 až mezi 1231 aminokyselinami. Obecně jsou NR domény velké přibližně 250 až 500 aminokyselin se silným nábojem ať již kladným nebo záporným (Zhou and Wu, 2009). Pomocí skenovacího elektronového mikroskopu byly SRRP lokalizovány na povrchu buňky, kde tvořili specifické struktury (Lauer et al., 2005, Wu and Fives-Taylor, 1999). 19

Glykosylované na serin bohaté oblasti pravděpodobně pomáhají nést NR domény v relativně velké vzdálenosti od buňky a zprostředkovávají tak možnou adherenci (Pyburn et al., 2011). Tento model podporuje experiment, kdy při experimentálním zkrácení délky serinového řetězce ztratil Streptococcus pneumonie schopnost adherovat na buňky plic (Shivshankar et al., 2009). SRRP také slouží jako určitá forma „záchytného lana“, která umožnuje držet biologické komponenty v blízkosti buněčné stěny (Lizcano et al., 2012).

4.3 Růst biofilmu a produkce EPS Po úspěšné adherenci, ať již pomocí pouze fyzikálních sil nebo za pomocí produkovaných adhezinů, začínají z jednotlivých bakterií postupným dělením vznikat mikrokolonie. Nově vznikající bakterie neodchází do roztoku kvůli produkovaným extracelulárním polymerickým substancím (EPS), které imobilizuje bakterie v biofilmu a udržuje je velmi blízko u sebe. Blízkost jednotlivých buněk umožnuje jejich intenzivní interakci, zahrnující komunikaci a formaci synergistických mikrokonsorcií (Flemming and Wingender, 2010). Díky sekreci extracelulárních enzymů zde vzniká také velmi všestranný externí trávící systém, který izoluje a zpracovává živiny z vodní fáze a umožňuje jejich maximální využití. EPS také udržuje dostupné všechny komponenty z lyzovaných buněk a tím se stává centrem recyklace. To zahrnuje i DNA, které v matrici biofilmu může kromě toho sloužit také jako rezervoár pro horizontální transfer genů. Samotné EPS může být také využito jako zdroj živin, ale díky jeho komplexnosti je nutná velká škála enzymů pro jeho úplné rozložení. Matrice dále chrání organismy před vyschnutím, oxidací, některými antibiotiky, kationty kovu, UV zářením, některými protozoi a v neposlední řadě chrání také před imunitním systémem hostitele. EPS různých biofilmů se může velmi lišit a závisí na přítomnosti mikroorganizmů, působících smykových sil, teplotě nebo dostupnosti živin (Flemming et al., 2007). Kromě EPS jsou důležitou složkou biofilmu také extracelulární struktury jako bičíky, pily nebo fimbrie, které napomáhají stabilizaci matrixu (Zogaj et al., 2001). Další zajímavou složkou biofilmu jsou membránové vezikuly gram-negativních bakterií obsahující velmi rozmanité množství enzymů a DNA (Schooling and Beveridge, 2006).

20

Obrázek č. 2: Schéma vývoje biofilmu. 1 – primární adheze planktonické bakterie na povrch; 2 - indukce ireverzibilní adheze pomocí produkce adhezinů a EPS; 3 – formování raných struktur biofilmu; 4 - maturace biofilmu; 5 – disperze buněk se struktury biofilmu (Kim et al., 2012). Struktura matrixu biofilmu Struktura EPS je velmi často specifická pro jednotlivé bakteriální druhy a je ovlivněna koncentrací, kohezí, nábojem, sorpční kapacitou, specifitou, původem jednotlivých EPS komponent a také jeho třírozměrnou prostorou strukturou (Sutherland, 2001). Výsledná morfologie biofilmu může být velmi rozmanitá a kromě jednoznačných struktur jako je např. hladká, plochá, drsná, nadýchaná, vláknitá nebo porózní může tvořit i různé morfologické regiony, které jsou typické hlavně u smíšených kultur (Flemming and Wingender, 2010). To ústí ke vzniku velmi rozdílných habitatů na malém prostoru a napomáhá větší biodiverzitě. Pomocí vizualizace konfokálním mikroskopem byla pozorována diferenciace rozdílných oblastí biofilmu a vznik mikrodomén (Lawrence et al., 2007). Jednotlivé regiony obsahovali rozdílné biochemické prostředí odpovídající různým subpopulacím. Velmi častým příkladem je růst anaerobních mikroorganizmů v podkladu biofilmové struktury, kde je snížená parciální koncentrace kyslíku. Důležitou strukturní charakteristikou všech vznikajících biofilmů je vznik strukturních kanálů, které jsou schopny rozvádět živiny po celé ploše biofilmu (Wagner et al., 2009). Vznik kanálků je způsoben úmrtím a lyzí bakterií a komplexnost kanálů je jedním se znaků maturace biofilmu. Bez možnosti rozvodu živin by nebylo možné přežívání buněk v hlubších vrstev biofilmu, kde je již prostá difúze nedostatečná. Dalším výrazným znakem biofilmu je jeho slizovitý charakter a adhezivita – lepkavost. To je způsobeno velkou mírou acetylace exopolysacharidů ve struktuře biofilmu. Vyšší počet acetylových skupin zvyšuje adhezivitu a kohézní vlastností EPS a ovlivňuje strukturu biofilmu 21

(Tielen et al., 2005, Franklin and Ohman, 1996). Také přítomnost negativně nabitých karboxylových skupin ovlivňuje mechanickou strukturu biofilmu například interakcí s kladně nabitými kationty jako je například Ca2+. Typickým příkladem důležitého mukózního proteinu je alginát produkovaný druhem Pseudomonas aeruginosa. Kmeny jej produkující mají výrazně mukózní charakter a tvoří fenotypově odlišné biofilmy (Korstgens et al., 2001). Exopolysacharidy v matrixu biofilmu Polysacharidy jsou důležitou složkou EPS matrixu (Frolund et al., 1996, Wingender et al., 2001). Jsou odpovědné za schopnost biofilmu uchovávat velké množství vlhkosti a způsobují vlastní slizovitý fenotyp. Většina z nich jsou dlouhé molekuly, lineární nebo větvené o velikosti od 0,5.106 do 2.106 daltonů. Některé exopolysacharidy byly pozorovány elektronovým mikroskopem jako jemná vlákna, která jsou přichycena k buněčnému povrchu a tvoří síť kotvící strukturu biofilmu k substrátu. Pomocí mikroskopických technik v kombinaci se specifikou vizualizací fluorescenčně značenými lektiny nebo protilátkami, stejně jako dalšími biochemickými metodami, byla potvrzena přítomnost exopolysacharidů nejenom v biofilmech vyskytujících se v přírodě, ale také v biofilmech spojených s chronickou infekcí u lidí a u biofilmů kultivovaných in vitro. (Flemming and Wingender, 2010). Některé exopolysacharidy jsou homogenní, například glukan, složený z jednotek glukózy produkovaný streptokoky v ústních biofilmech nebo celulóza produkovaná např. Agrobacterium tumefaciens, Gluconacetobacter xylinus, Rhizobium spp. a dalšími druhy z čeledi Enterobacteriaceae a Pseudomonadaceae (Zogaj et al., 2001, Wingender et al., 2001). Nicméně většina polysacharidů jsou heterogenní a skládají se ze směsi nabitých a neutrálních cukerných jednotek. Mohou také obsahovat různorodé organické a anorganické substituenty, které velmi ovlivňují jejich fyzikální a biologické vlastnosti. Jmenovitě například přítomnost močové kyseliny, alginátu, xanthanu nebo glukonové kyseliny dává exopolysacharidu polyaniontovou charakteristiku. Příkladem polykationtu je například intracelulární adhezin (PIA) β- 1,6 Nacetylglukosamin (PIA). Tento adhezin byl objeven u důležitých nozokomiálních patogenů S. aureus a S. epidermidis, které mohou kolonizovat implantáty a mohou vést až ke smrtelným infekcím (Debeer et al., 1994). Kromě stafylokoků byl také PIA objeven u řady dalších bakteriálních kmenů (Flemming and Wingender, 2010). Extracelulární proteiny Objem produkovaných extracelulárních proteinů tvoří největší podíl sušiny u biofilmů (Conrad et al., 2003, Frolund et al., 1996). Největší skupinu extracelulárních proteinů tvoří enzymy s velmi důležitou podskupinou EPS modifikujících enzymů. Další důležitou skupinou jsou strukturní proteiny biofilmu. 22

Bylo popsáno též velké množství enzymů vyskytujících se v biofilmech, z nichž je většina spojena s degradací biopolymerů. Substráty pro tyto enzymy jsou nejenom polysacharidy, proteiny a nukleonové kyseliny, tedy ve vodě rozpustné polymery, ale také ve vodě nerozpustné sloučeniny jako je celulóza, chitiny a lipidy (Flemming and Wingender, 2010). Přítomnost velkého množství těchto enzymů v EPS dělá z matrixu jakýsi externí trávící systém, který štěpí biopolymery na jednoduché sloučeniny. Jiná skupina enzymů může štěpit vlastní složky EPS a často slouží jako primární aktivátory disperze biofilmu. Mnoho extracelulárních enzymů je díky své schopnosti štěpit pojivové struktury hostitele považováno za důležité virulentní faktory u klinicky závažných biofilmů. Extracelulární enzymy jsou zadržovány ve struktuře biofilmu pomocí slabých vazebných sil s polysacharidy (Flemming and Wingender, 2010). Enzymy štěpící komponenty EPS jsou exprimovány hlavně pokud dochází k dlouhodobému snížení koncentrace živin v prostředí a tvoří je stejný druh bakterií, který produkoval i vlastní složky matrixu. Výjimku tvoří EPS degradující enzymy, které štěpí extracelulární komponenty kompetitivního kmene. Tyto enzymy jsou produkovány neustále (Zhang and Bishop, 2003). U mořských stromatolitů jsou EPS polysacharidy a proteiny produkované bakteriemi velmi rapidně a intenzivně rozštěpeny sulfát redukujícími bakteriemi a jednotlivé jednotky jsou přestavěny na odolnější polymery (Ude et al., 2006). Dále jsou EPS degradující enzymy velmi důležité pro finální fázi biofilmu a to biofilmový rozpad – (detachement), který umožňuje opětovný přechod na planktonický způsob života a kolonizaci dalších povrchů. Další skupinu extracelulárních proteinů tvoří strukturních proteinů mezi které patří: proteiny spojené s povrchem buněk např. Bap (biofilm associated protein) protein u druhu S. aureus a jemu podobné proteiny u jiných druhů (Lasa and Penades, 2006), amyloidy, které jsou spojené a s adherencí na neživé povrchy (Otzen and Nielsen, 2008) a strukturní komponenty na povrchu buňky, tedy pily, fimbrie a bičíky. Extracelulární DNA Extracelulární DNA (eDNA) byla nalezena v rozmanitých biofilmech tvořených různými bakteriálními druhy a bylo pozorováno, že její množství v biofilmech je mezi příbuznými druhy velmi podobné (Frolund et al., 1996). Existují, ale i výjimky, kdy například u biofilmu S. aureus tvoří eDNA významnou složku EPS, tak u biofilmu S. epidermidis tvoří eDNA jenom velmi minoritní složku (Izano et al., 2008). I když se zpočátku myslelo, že eDNA je původně pouze odpad z lyzovaných buněk, je stále více jasné, že eDNA tvoří důležitou komponentu EPS matrice (Molin and Tolker-Nielsen, 2003). Ať již z hlediska horizontálního přenosu genů nebo z hlediska strukturního. Důležitost 23

nukleové kyseliny v agregaci mikroorganizmů byla pozorována na rodu Rhodovulum, jedním ze zástupců autoflokulujících bakterií (Watanabe et al., 1998). Ošetření flokulujících buněk nukleotickými enzymy vedlo k deflukulaci, zatímco enzymy degradující polysacharidy a proteiny neměli žádný viditelný efekt. Kromě toho má eDNA také důležitou antimikrobiální aktivitu díky svým chelatačním vlastnostem, které odstraňují kationty stabilizující lipopolysacharidy ve vnější buněčné membráně (Mulcahy et al., 2008). Surfaktanty a lipidy Extracelulární polysacharidy, proteiny a DNA jsou hydratované hydrofilní molekuly, zatímco právě surfaktanty a lipidy tvoří hydrofobní složku biofilmu. Lipidy se běžně nacházejí v biofilmové matrici a stejně jako lipopolysacharidy fungují také jako složky aktivní adherence (Conrad et al., 2003). Surfaktanty jsou produkovány bakteriemi na rozhraní vzduchu a kapaliny a tím ovlivňuji její povrchové napětí a zvyšují možnost výměny plynů (Leck and Bigg, 2005). Například u P. aeruginosa byly nalezeny rhamnolipidy, které jsou odpovědné za primární tvorbu mikrokolonií, podporují migraci bakterií po površích, formaci houbovitých struktur a pravděpodobně hrají důležitou roli v mikrobiální disperzi (Davey et al., 2003, Boles et al., 2004).

4.4 Specifika biofilmu stafylokoků Biofilmy stafylokoků se mohou vyskytovat na implantátech, způsobují perzistující infekce a jsou velmi často důvodem pro odstranění implantátu (Montanaro et al., 2011). Mezi vedoucí etiologické agens patří S. aureus, S. epidermidis a další koaguláza negativní stafylokoky (CNS). Bakterie se do kontaktu s implantátem dostávají buď během chirurgického zákroku, nebo později během dočasné bakteriémie, kdy následně adherují na povrch materiálů a tvoři biofilm, který je velmi odolný k odstranění. U S. epidermidis byl nalezen výrazný faktor způsobující bakteriální adhezi jednotlivých buněk k sobě samým. Tento produkt byl nazván polysacharidový intracelulární adhezin (PIA) a je považován za jeden z klíčových faktorů nutných pro tvorbu biofilmu. Produkce PIA je podmíněna přítomností ica lokusu a proto jsou biofilmy složené z PIA někdy označovány jako ica-dependentní. Později byly objeveny další proteiny, které umožnují také tvorbu biofilmu i u kmenů, které tento gen postrádají a umožnují tvorbu tzv. ica-nezávislého biofilmu.

4.4.1 ica–dependentní biofilm PIA

je

homoglykanový

polysacharid

složený

z

opakujících

se

jednotek

β-1,6-N-acetylglukósaminu (Sadovskaya et al., 2005). Průměrně 80 až 85 % polysacharidu je acetylováno na dusíku, zatímco zbytek acetylován není a je pozitivně nabitý. PIA kromě zvýšené adherence k cévnímu endotelu a močovému epitelu také vykazuje zvýšenou adherenci na polyvinylchloridové katetry (Costa et al., 2009, Rupp et al., 1999). Existují dvě hlavní teorie 24

důležitosti PIA pro tvorbu biofilmu: (i) role PIA v primární adherenci je způsobena pouze a jen akumulaci biofilmových buněk (Mack et al., 1994, Mack et al., 1996); (ii) PIA účinkuje na mnohem složitější úrovni a hraje svou roli i udržení stability raných struktur biofilmu a primární adherenci bakterie k substrátu (Mohamed et al., 1999, Cerca et al., 2005). Produkce PIA je podmíněna přítomností ica operonu, který se skládá se čtyř čtecích rámců. Bylo zjištěno, že právě PIA je hlavní podmínkou vzniku biofilmů u klinicky významných infekcí a stejný polymer byl následně identifikován také přímo u S. aureus (Cramton et al., 1999). I když byla prokázána přímá souvislost mezi přítomností ica lokusu a tvorbou biofilmu u klinicky významných kmenů stafylokoků, existují i další extracelulární polymery které umožnují formování biofilmu i u ica negativních kmenů stafylokoků (Ruzicka et al., 2004). Například tzv. Aap protein asociovaný s agregací mikroorganizmů (Rohde et al., 2005) a Bap protein objevený u Staphylococcus aureus a jeho homolog bhp protein u S. epidermidis (Sadovskaya et al., 2005) jsou další proteiny, které umožňují vznik biofilm u ica negativních kmenů stafylokoků. Syntéza PIA je zprostředkována chromozomálním ica lokusem, který má operonovou strukturu. Regulační funkci má icaR gen, který je přepisován v obraceném směru než zbývající strukturní geny icaADBC. Po aktivaci operonu jsou translatovány čtyři proteiny icaA, icaB, icaC a icaD, které jsou nezbytné pro syntézu PIA (Cafiso et al., 2004). Vlastní syntéza PIA probíhá pomocí N-acetylglukósamyniltransferázy (kódované icaA genem) z UDP-N-acetylglukósaminu. Exprese samotného genu icaA indukuje nízkou enzymatickou aktivitu a vede k produkci malého množství polysacharidu. Nicméně simultánní exprese icaA a icaD způsobuje výrazné zvýšení koncentrace

enzymu

N-acetylglukósamyniltransferázy a

následný

nárůst

koncentrace

polysacharidu PIA (Dobinsky et al., 2002). Syntéza dlouhých oligomerů, které obsahují více než 130 reziduí je spuštěna icaC genem. Zdá se, že icaB gen pouze ovlivňuje sekreci bez přímého ovlivnění biosyntézy PIA (Gerke et al., 1998).

4.4.2 ica-nezávislý biofilm Bylo pozorováno, že u některých kmenů S. aureus i po deleci ica lokusu nedošlo k ovlivnění schopnosti daného kmene tvořit biofilm (O'Gara, 2007). To je dáno alternativním mechanismem tvorby biofilmu, který je založen na produkci velké palety adhezivním proteinů, které kromě adheze na substrát, drží také klastry buněk u sebe a umožňují jejich vzájemnou interakci. Bylo zjištěno, že i výše zmíněný adhezin Bap může nahrazovat funkci PIA ve formování biofilmu (Cucarella et al., 2001).

Bap je povrchový protein, který byl původně nalezen

v transpozonu vnořeném v ostrovu patogenity (Lasa and Penades, 2006). Původně byl Bap protein nalezen u S. aureus ale dnes byl identifikován u mnoha dalších druhů včetně S. epidermidis, S. 25

chromogenes, S. simulans a S. hyicus (Tormo et al., 2005). Co se týče S. aureus, byly kmeny produkující Bap nalezeny pouze v souvislosti mastidou vemene u krav a žádné kmeny nebyly nalezeny u klinicky významných humánních vzorků. Zatímco u CNS byli Bap produkující kmeny nalezeny i v klinických izolátech. Dalším zajímavým proteinem, který se účastní formování biofilmu je již několikrát výše zmíněný Aap (Los et al., 2010). Za tvorbu biofilmu je odpovědná hlavně produkce zkrácené 140 kDa varianty Aap (z 220 kDa varianty celého proteinu) (Rohde et al., 2005). Tato zkrácená forma může za přítomnosti Zn2+ iontů tvořit dimery a přispívat tak k zesítění EPS (Conrady et al., 2008). Mezi další proteiny odpovědné za produkci biofilmu patří povrchové proteiny SasG (Geoghegan et al., 2010), SasC (Schroeder et al., 2009), již zmiňované FBP (O'Neill et al., 2008), protein A (Merino et al., 2009), Embp (Christner et al., 2010) a pravděpodobně i teichoové kyseliny (Holland et al., 2011).

4.5 Metody kultivace biofilmů Metoda kultivace velmi výrazně ovlivňuje vznik biofilmu a jeho finální strukturu a pevnost. Proto bylo prozkoumáno velmi široké množství postupů pro správnou kultivaci bakteriálního biofilmu, které se liší složením kultivačního média, přítomností agitace vzorku během kultivace nebo například přítomnosti rozhraní kapaliny a vzduchu.

4.5.1 Metody statické kultivace biofilmů Výhody statických kultivací je několik. První z nich je možnost studovat detailně biofilm v jeho rané fázi formováni (Merritt et al., 2005). Toho může být využito například pro výzkum látek, které modulují změnu fenotypu planktonických buněk na biofilmové, další výhodou je většinou jednoduchost provedení experimentu a nenáročnost na přístrojové vybavení, což umožňuje kultivaci většího množství vzorků najednou. Poslední výhodou je velká prostupnost některých statických metod, které mohou být využity například na screeningové metody geneticky modifikovaných kmenů. Metody využívající mikrotitrační destičku Nejčastější přístup při statické kultivaci je využití mikrotitrační destičky s případnou povrchovou úpravou jamky. Základní metodikou je klasická kultivace alikvotů v jednotlivých jamkách. Po kultivaci je jamka vypláchnuta a vzniklý biofilm je nabarven a vyhodnocen (Christensen et al., 1985) (viz. dále). Kromě této klasické kultivace a vyhodnocení barvením je možné zjistit hodnoty CFU kultivací po uvolnění mikroorganismů sonifikací jednotlivých jamek. Jamky je doporučeno sonifikovat oddělené, odstřižené ve větších zkumavkách, což je ale spojeno s nebezpečím nedefinovatelného prasknutí destičky. 26

Další možnou úpravou je statická kultivace na rozhraní vzduchu a kapaliny pomocí nahnutí mikrotitrační destičky do úhlu 300 až 500 a opatrném naplnění jamek alikvoty s bakteriální kulturou (Caiazza and O'Toole, 2004). Podobného rozhraní lze dosáhnout i tím, že do každé jamky je vloženo krycí mikroskopické sklíčko. Na rozhraní kapaliny a vzduchu je možno po vytáhnutí sklíčka pozorovat hledaný biofilm.

Obrázek č. 3: Schéma statické kultivace v mikrotitrační destičce na rozhraní kapaliny a vzduchu. A – náhled zezadu, B – náhled z boku. Mikrotitrační destička (a) je podepřena papírovými svorkami (b). (převzato z (Merritt et al., 2005)). Dalším upravením mikrotitrační destičky, systém se nazývá Kadouri drip-fed, lze získat nástroj pro dlouhodobou statickou kultivaci díky obnově kultivačního média. Tato metoda je založena na postupném přikapávání a pomalém odsávání média v mikrotitrační destičce pomocí jehel upevněných ve víčku (Merritt et al., 2005).

Obrázek č. 4: Nákres Kadouri drip-fed systému. (převzato; upraveno (Merritt et al., 2005)). Médium je přiváděno (1) pomocí pumpy a jehly (2) zabodnuté do víčka mikrotitrační destičky. Pomocí druhé jehly (3) je médium odsáváno do odpadu (4).

27

Dalším přístupem je např. Calgary Biofilm Device (CBD), metoda využívající pro kultivaci biofilmu výstupky z víčka destičky. Metoda kolonového biofilmu Mírně odlišnou metodou statické kultivace je kultivace kolonií na agaru. Pro biofilmové aplikace je vzorek kultivován na prostupné membráně, položené na pevném kultivačním médiu, kterou lze v po vyčerpání živin přenést (Walters et al., 2003). Toto lze využít pro jednoduchou změnu zdroje uhlíku nebo pro vyzkoušení rozsáhlé palety antibiotické rezistence na jedné kolonii biofilmu. Je to také jediný protokol, kde není přítomna kapalná fáze a biofilm je tvořen na tuhém substrátu. S tím se pojí velmi výrazná fenotypová podobnost biofilmu s klasickými koloniemi. Na rozdíl od kolonií ale může být tento biofilm mnohonásobně větší hlavně díky prodloužené době kultivace. Velkou výhodou tohoto přístupu je možnost sledování změn množství bakterií v kolonii biofilmu. Jakákoli změna je dána pouze množením bakterií již přítomných v biofilmu nebo. Nemůže zde docházet k uvolnění bakterií z biofilmu nebo invadování biofilmu motilními bakteriemi.

4.5.2 Metody dynamické kultivace biofilmu Vliv hydrodynamických sil na tvorbu biofilmu je velmi komplexní a jejich vliv není ještě dostatečně popsán (Garny et al., 2008). Například bylo pozorováno, že smyková síla (shear force) určitým způsobem brání rozvoji biofilmu v raných fázích, zatímco podporuje sílu adherence již maturované struktury (Garny et al., 2008). Teoreticky během první fáze adherence bakterií může smyková síla zvýšit plochu, na kterou se mohou bakterie dostat během prvních fází adherence (Lecuyer et al., 2011). Nicméně jsou studie, které pozorují inhibiční vliv smykových sil na rozvoj biofilmu. Biofilmu formované během působení velkých smykových sil jsou tenčí (Salek et al., 2009), maturace biofilmu je opožděná a je pozorována snížená diverzita bakteriálních druhů (Rochex et al., 2008). Nicméně tento typ biofilmu lépe připomíná biofilm vznikající mimo laboratoř a je velmi zajímavý z hlediska distribuce živin (Mohle et al., 2007). Nejčastějšími metodami dynamické kultivace jsou CDC biofilmový reaktor (licencovaný Centers for Disease Control (CDC)), průtokové cely s variacemi např. Modified Robbins Device (MRD) a nově též mikrofluidní kultivace. Všechny metody mají velkou výhodu možnosti definovat přesně hydrodynamickou sílu působící na vzorek a poskytují replikovatelné biofilmy. CDC biofilmový reaktor CDC biofilmový reaktor je komerčně dostupný (např. Biosurface Technologies) a je rozsáhle používán pro kultivaci reprodukovatelných biofilmů například u druhu S. epidermidis (Williams and Bloebaum, 2010). Reaktor je založen na kultivaci na vhodných kupónech 28

(insertech), které mohou být připraveny z téměř jakéhokoli materiálu. Kupón je vložen do držáku upevněného v nádobě. Medium s bakteriemi je promícháváno pomocí magnetického míchadla. Přesné nastavení otáček a znalost vnitřního prostředí umožňuje působit definovanou smykovou silou na biofilmy rostoucí na kuponech. Po vyjmutí může být kupón analyzován např. konfokálním mikroskopem, uvolněním bakterií z kuponu a kultivací anebo klasickým barvením krystalovou violetí.

Obrázek č. 5: A - nákres CDC biofilmový reaktor od Biosurface Technologies (převzato; upraveno (Williams and Bloebaum, 2010)); B - příklad mikrofluidního čipu pro sledování vlivu kyslíku na růst biofilmových struktur (převzato (Kim et al., 2012)). Průtokové komory Průtoková komora (flow cell) je ve většině případů tvořena drážkou, která je přes těsnění kryta tenkým krycím sklem (Benoit et al., 2010). Sklo je buď drženo přírubou, nebo je na celu lepeno. U některých typů je možné do vlastní komory vkládat kupóny z různých materiálů a přes krycí sklo přímo sledovat biofilm pomocí mikroskopu. Komorou pomocí přívodních a odvodných kanálů protéká médium. Pro tok média se převážně využívá peristaltické čerpadlo. Hydrodynamické podmínky jsou definovány tvarem komory a rychlostí toku média. Při nevhodném tvaru komory nebo při vyšší rychlosti toku nastává turbulentní proudění. Inokulace se může provádět přes vstupní port nastříknutím bakteriální kultury do komory s adekvátní, statickou kultivací. K průtokové cele se většinou zapojuje zachytávač bublin, který slouží k odstranění bublin, které by mohly zavzdušnit vlastní celu a též slouží k zabránění kontaminace zásobníku média z inokulované cely růstem/pohybem mikroorganismů proti proudu. Průtokové cely se často vyrábějí nebo umisťují vedle sebe, což umožňuje paralelní sledování za různých podmínek. Je ale nutné, aby každá cela měla vlastní čerpadlo a zachytávač bublin, nebo hrozí

29

křížová kontaminace a nesouměrnost toku. Nejjednodušším typem průtokové cely je kapilára připojená na hadičky z PVC. Mikrofluidní systémy pro dynamickou kultivaci biofilmu Specializované mikrofluidní systémy mohou být využity na prakticky jakoukoli aplikaci výzkumu biofilmu, např. sledování reakce na působené podměty a také high-throughput analýzu mnoha biofilmů v jednom experimentu (Benoit et al., 2010). Pomocí počítačového modelování lze odhadnout působící hydrodynamické síly na biofilm během růstu a sledovat vlivu na růst biofilmu (Salek et al., 2009). Dále lze pozorovat např. vliv koncentrace antibiotik (Lee et al., 2008), kyslíku (Skolimowski et al., 2010), schopnost šíření biofilmů (Mao et al., 2003) a to vše za možnosti pozorování růstu biofilmu v reálném čase.

4.6 Metody detekce biofilmu Metody detekce biofilmu jsou založeny na dvou rozdílných přístupech. Prvním jsou fenotypové metody, kdy je pozorována přímo schopnost daného kmene tvořit biofilm za daných podmínek. Mezi tyto metody patří například zkumavkový test, test kultivace v mikrotitrační destičce a kultivace na kongo red agaru (Růžička et al., 2006). Druhou skupinou jsou genotypové metody, kde jsou detekovány geny odpovědné za schopnost daného kmene tvořit biofilm. Zde se prakticky používá pouze detekce ica lokusu kmenů S. aureus a S. epidermidis. Genotypové metody jsou založeny na detekci založené na PCR reakci. Velmi často se spolu s ica lokusem hledají také geny odpovědné za resistenci k antibiotikům. Dále budou popsány pouze fenotypové metody.

4.6.1 Barvení biofilmu Pro kolorimetrické stanovení biofilmu a jeho kvantifikaci jsou využívána barviva jako je krystalová violeť, safranin nebo alciánová modř (Christensen et al., 1985). Krystalová violeť je velmi vhodná látka pro identifikaci biofilmu na polystyrenu. Barva se váže specificky na bakterie a na EPS produkované biofilmem. Tato vazba je velmi rychlá (do 5 min) a nenavázaná krystalová violeť jde velmi snadno vymýt. Barvení a následné kolorimetrické stanovení využívají dvě klasické metody detekce biofilmu. Zkumavkový test Princip testu spočívá v obarvení EPS suspenze bakterií po kultivaci ve skleněné nebo polystyrenové zkumavce (Christensen et al., 1982). Např. pro rozlišení biofilm pozitivních a negativních stafylokoků se využívá jako kultivační médium mozkosrdcová infúze nebe tryptosójový bujón obohacený o glukózu 1 až 5% (Knobloch et al., 2002). Po kultivaci se vzniklý biofilm barví safraninem, alciánovou modří nebo krystalovou violetí (Mathur et al., 2006). 30

Biofilm pozitivní kmeny tvoří zřetelný zákal podél celé kultivační plochy, zatímco u biofilm negativních kmenů dojde k obarvení pouze plochy na rozhraní média a vzduchu. Nevýhodou této metody je nemožnost objektivní kvantifikace a nemožnost rozlišení různých stupňů biofilm pozitivity a biofilm negativity. Test tvorby biofilmu v mikrotitračních destičkách Test vzniku biofilmu v mikrotitrační destičce je modifikací testu sledování biofilmu ve zkumavkách. Jedná se v podstatě o jeho miniaturizaci s možností kvantifikace. Suspenze bakterií se kultivuje ve vhodném médiu, např. stafylokoky nejčastěji v tryptosójovém bujónu se zvýšenou koncentrací glukózy, je kultivována v mikrotitrační destičce upravené pro tkáňové kultury (Christensen et al., 1985). Tato úprava je velmi důležitá, protože na rozdíl od klasického polystyrenu je zde dno jamky nabité a stafylokokové biofilmy se na tomto povrchu tvoří snadněji (Gracia et al., 1997). Po nárůstu biofilmu je jamka jemně promyta, biofilm je zafixován a nabarven krystalovou violetí. Následně je jamka vypláchnuta a po vyschnutí destičky je množství biofilmu v jamce kvantifikováno pomocí vyplavení barviva ethanolem a měřením absorbance na čtečce mikrotitračních destiček (Stepanovic et al., 2000). Hodnoty vlnových délek se v různých studiích liší, ale obecně se pohybuje mezi 570 nm (Mathur et al., 2006) a 470 nm (Oliveira and Cunha Mde, 2010). Podle srovnávacích studií je specifita této metodiky velmi podobná zkumavkovému testu a přesahuje 95 % (Oliveira and Cunha Mde, 2010, Mathur et al., 2006).

4.6.2 Metoda detekce pomocí kultivace na kongo červeň agaru Další pouze kvalitativní metoda spočívá ve sledování morfologických změn kolonií biofilm negativních a biofilm pozitivních kmenů při kultivaci na agaru s přítomnou kongo červení (Freeman et al., 1989). Během růstu dochází k obarvení kolonií kongo červení a tím ke zviditelnění kmenů, které produkují EPS. Po 24 hodinové kultivaci jsou biofilm pozitivní kmeny výrazně černé s krystalovou strukturou, biofilm negativní kmeny jsou zpravidla růžové a kolonie s pouze černým středem jsou hodnoceny jako střední producenti biofilmu. Některé další studie odlišují kolonie producentů biofilmu různého stupně podle více rozpracované barevné škály a přítomností nebo absencí krystalových struktur v koloniích (Mathur et al., 2006, Arciola et al., 2002). Přesto se přesnost identifikace kmenů tvořící biofilm pohybuje pouze od 40 do maximálně 80 % ve srovnání s klasickým zkumavkovým testem (Mathur et al., 2006, Oliveira and Cunha Mde, 2010). Je to hlavně způsobeno nespecifickým barvením jiných látek produkovaných bakteriemi než pouze EPS a vzniku falešně pozitivních výsledků.

4.6.3 Skenovací laserová konfokální mikroskopie (CLSM) Mikroskop používaný pro CLSM je ve své podstatě modifikovaný epifluorescenční mikroskop, který dokáže zaostřit na definovanou hladinu (tlustou přibližně 0,3 µm) a blokuje 31

signál přicházející z jiných hladin. Toho je dosaženo optickou bariérou – tzv. štěrbinou (Palmer and Sternberg, 1999). Jako excitační zdroj je zde použit laserový paprsek pro dosažení hluboké penetrace zkoumaného vzorku a koherence. Fluorofor, který znační přítomnost vzorku je excitován a jeho následná fluorescence je detekována fotonásobiči. Díky přesnému zaostření hladin s minimalizací šumu je možné snímat vzorek v jednotlivých vrstvách. Právě CLSM představuje univerzální a do jisté míry nedestruktivní metodu pozorování biofilmu. Velkou výhodou je možnost použití viabilního vzorku přímo v roztoku bez nutných úprav a fixace. Pomocí CLSM je možné pozorovat přímo strukturu biofilmu, jeho rozložení a je možné i pozorování značených látek a jejich distribuce v biofilmové struktuře (Lawrence and Neu, 1999, Tolker-Nielsen et al., 2000). Pomocí kombinace CLSM a kultivace vzorku v 96jamkové mikrotitrační destičce je možné velmi rychle a intenzivně zkoumat kvalitu a kvantitu biofilmových struktur (Bridier et al., 2010). U biofilmu lze využít sledování vývoje biofilmu v reálném čase a možnost popisu jeho stavby a složení (Costerton et al., 1994). Toho bylo využito např. pro detekci rozložení živin v biofilmu, modelaci proudu kapaliny a distribuci signálních molekul. Nevýhodou, ale ovšem je nutné fluorescenční značení biofilmu před vlastním pozorováním. Vzhledem k přítomnosti vysokého množství extracelulární DNA v některých typech biofilmu je možné použít i fluorescenční značky specificky vázající DNA.

4.6.4 Kapilární elektromigrační techniky Vysokoúčinná kapilární elektroforéza je analytická metoda pro separaci nabitých biomolekul. Princip je založen na separací nabité molekuly v elektrickém poli na základě své elektroforetické mobility nebo izoelektrického bodu. V případě separace celých bakterií dochází k oddělení na základě přítomnosti nabitých skupin v povrchové matrici. Např. při rozlišení biofilm pozitivního a biofilm negativního kmene S. epidermidis (Ruzicka et al., 2007) dochází ke zřetelnému oddělení biofilm pozitivního kmene díky přítomnosti PIA na povrchu buňky, který obsahuje volné amino skupiny a uděluje tím bakteriím kladný náboj (Vuong et al., 2004). Jednou z metod je kapilární zónová elektroforéza. Ta je založena na rozdělení částic podle jejich elektroforetické pohyblivosti, která je přímo úměrná výslednému náboji a nepřímo úměrná viskozitě roztoku a poloměru částice. Kromě tohoto pohybu je zde přítomen ještě elektroosmotický tok, který v důsledku aplikovaného stejnosměrného elektrického pole táhne celý roztok směrem ke katodě před kterou je umístěn i detektor. Byla prokázána účinná separace a odlišení biofilm pozitivního a negativního kmene S. epidermidis pomocí fluorescenčního značení kyselinou 1,4-pyren máselnou (Horka et al., 2005). Další metodika založená na rozdělení podle izoelektrického bodu se nazývá kapilární izoelektrická fokusace. Zde je separace založena na migraci částice v elektrickém poli a gradientu 32

pH do míst, kde se pH rovná izoelektrickému bodu a částice zde ztratí náboj. Po ustanovení rovnováhy a separace všech složek jsou jednotlivé separované oddíly vzorku vypuzeny z kapiláry směrem k detektoru pomocí přetlaku nebo podtlaku na jednom konci kapiláry. Také touto metodou byly úspěšně rozlišeny biofilm pozitivní a negativní kmeny S. epidermidis (Ruzicka et al., 2007). Zároveň byl také např. pozorován vliv ultrazvuku na oba kmeny před separací, kdy při sonifikaci ultrazvukem byl pozorován posun času migrace biofilm pozitivního kmene blíže k času biofilm negativního kmene, zatímco u biofilm negativního kmene nebyla pozorována žádná změna. To odpovídá představě, že příčinou rozdílu je přítomnost EPS na povrchu bakterie.

4.7 Biosenzor Biosenzor v užším slova smyslu je zařízení, které detekuje zkoumaný analyt pomocí specifické interakce biologické složky pevně imobilizované na povrch detektoru (Dzyadevych et al., 2008). V širším slova smyslu může být jako biosenzor označováno i zařízení, kde je biorekogniční složka vlastním analytem. Počátky vzniku biosenzorů se dají vysledovat k původní úpravě Clarkovi kyslíkové elektrody (Clark and Clark, 1987). U tohoto předchůdce biosenzoru byla imobilizována glukózoxidáza na membránu propustnou pro kyslík, která oddělovala Clarkovu elektrodu od zbývajícího roztoku. Tento princip byl postupně zdokonalen a byl zaveden pojem enzymová elektroda a následně pojem biosenzor. Během dalšího vývoje se kromě enzymů se začalo používat rozmanitých jiných biologických složek a byla prozkoumána celá plejáda mechanismů převádění interakce biologických složek na elektronický signál. Dnes jsou pomocí biosenzorů zkoumány také např. interakce DNA-DNA, DNA-protein, receptor-ligand, proteinligand,

protilátka-antigen

a

mnoho

dalších

biologicky

interagujících

dvojic.

Snad

nejrozšířenějším zástupcem biosenzoru je dnes glukózový biosenzor využívaný při kontrolování hladiny glukózy v krvi diabetiků.

Obrázek č. 6: Schéma glukózového biosenzoru na elektrochemickém převodníku. Vlevo je stavba klasického biosenzoru pouze s imobilizovaným enzymem. Vpravo je biosenzor s imobilizovaným mediátorem, který pomáhá převádět signál na elektrodu (převzato, upraveno (Newman and Turner, 2005)).

33

Funkčně se tedy biosenzor skládá ze dvou částí: (i) biologické složky, která je imobilizována na povrchu převodníku a z (ii) fyzikálně-chemického převodníku, který mění signál biologické složky na elektronickou odpověď.

4.7.1 Biorekogniční složky biosenzoru Nejčastější využívanou biorekogniční složkou biosenzorů je stále enzym. Při použití enzymů se totiž naskýtá možnost nejen selektivně vázat hledaný analyt, ale zároveň je většinou produkt enzymatické reakce značkou, kterou následně využívá elektrochemický převodník. Příkladem je výše zmíněný glukózový biosenzor, kde je v nejstarším provedení použita kombinace enzymů glukózoxidázy a peroxidázy (Wang, 2001). Na elektrodách následně probíhají reakce: 𝐺𝑂𝑥

glukóza + kyslík →

𝑝𝑒𝑟.

H2O2 →

glukonová kyselina + H2O2

(3)

O2 + 2H+ + 2e-

(4)

Uvolněné elektrony jsou následně detekovány elektrodou. V dalším vývoji se ukázalo velmi užitečné použití mediátorů, které jsou schopny oxidovat enzymy v tomto případě glukózoxidázu. Redukovaná forma mediátoru následně přenáší náboj na elektrodu viz. obrázek č. 6. Dalším typem biorekogniční složky jsou protilátky, které jsou pevně imobilizované na povrch převodníku. Svým sestavením tento biosenzor připomíná ELISU systém s tím rozdílem, že detekce navázání protilátek probíhá pomocí převodníku a ne pomocí kolorimetrické změny (Yao et al., 2010). Velmi slibné se zdá využití protilátek na křemíkovém typu převodníků - quartz crystal microbalance (viz. níže) (Tyan et al., 2011). Mezi další typy biologických složek biosenzorů patří také antigeny, nukleové kyseliny a v neposlední řadě také celé mikroorganismy. Hlavně poslední zmíněná složky představuje jednoduchý a velmi efektivní způsob jak nahradit většinu klasicky používaných biologických složek a zjednodušit tak přípravu kompletního biosenzoru (Branco et al., 2013). Celá buňka může nahradit enzymy, antigeny i případné specifické proteiny pokud je exprimuje na svém povrchu.

4.7.2 Fyzikálně-chemické převodníky biosenzorů Jak již bylo zmíněno výše u biosenzorů je biologické složka pevně spojena s fyzikálně chemickým převodníkem, který převádí biologický signál na elektronický. Je využívána velmi široká paleta různých převodníku. Nejčastěji doposud využívaným převodníkem je stále elektrochemický. Mezi další převodníky patří například optické a piezoelektrické, které jsou 34

zmíněny dále. Impedanční spektroskopie je speciální forma elektrochemického převodníku, která bude zmíněna ve zvláštní kapitole. Elektrochemické převodníky Patří mezi nejstarší typ převodníků a našel velmi široké uplatnění v širokém spektru vědních oborů. Principiálně jde o převod volných elektronů mezi enzymem a elektrodou nebo o změnu odporu měřeného vzorku (Paleček, 1996). Elektrochemický převodník tedy měří změnu napětí (amperometrie), proudu (voltametrie) nebo odporu vzorku (konduktometrie). Speciální aplikací je použití cyklické voltametrie (CV), metody odvozenou od polarografie. Během CV je potenciál lineárně zvyšován, až dosáhne hodnoty zvoleného zlomu a následně je lineárně snižován znovu na počáteční hodnotu. Tento cyklus je následně mnohonásobně opakován a následná grafická analýza vykreslení závislosti napětí nám dává informaci o povrchu elektrody a o přítomnosti oxidačním a redukčních molekul v roztoku. Speciální typ elektrochemického převodníku je impedanční spektroskop, který je popsán v samostatné kapitole. Při použití enzymu jako biorekogniční složky elektrochemického převodníku je vhodné vlastní enzymatickou reakci provádět v dostatečné vzdálenosti enzymu od elektrody (Moyo et al., 2012). V případě přímé imobilizace enzymu na elektrodu je většinou enzym stericky blokován a reakce není tak účinná. Nicméně naopak při velké vzdálenosti enzymu od elektrody již dochází ke ztrátám případných uvolněných elektronů. Proto se jako velmi výhodné jeví použití mediátorů, kde pomocí série oxidačně-reakčních reakcí převádějí náboj z enzymu na elektrodu. Optické převodníky Optické převodníky jsou založeny detekci změn ve světelné adsorpci nebo emisi během reakce biorekogniční složky analytu. Optická změna je zachycena pomocí optického vlákna. Jedním z používaných sestav je imobilizace afinitní biorekogniční složky a fluorescenční značení analytu.

Používanými

značkami

je

například

fluorescein-5-isothiokyanát

nebo

tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát (Li et al., 2004). Jiný typ přístupu může být například imobilizace citlivé fluorescenční značky, které reaguje na přítomnost analytu poklesem intenzity fluorescence. Speciálním typem optického převodníku může být například měření rezonance povrchového plazmonu. Tento typ převodníku je založen měření změny rezonance během osvitu kovové částice v závislosti na úpravě povrchu. Tímto způsobem jsou například analyzovány antigeny navázané na protilátkách imobilizované na zlatém filmu. Při použití určitých vlnových délek v blízkosti infračerveného světla dochází k resonanci, která se liší podle přítomnosti nebo absenci antigenu navázaných na protilátkách. Tento posun resonance k delším vlnovým délkám odráží také koncentraci navázaného antigenu (Nanduri et al., 2007). 35

Piezoelektrické převodníky Jako převodník je zde využit křemíkový krystal, který kmitá na určité frekvenci v závislosti na přivedeném napětí. Pokud je změněna hmotnost krystalu, třeba navázáním určitých látek, posouvá se i frekvence oscilace krystalu. Z toho posunu lze určit nárůst hmotnosti na krystalu (Skladal, 2003). Kromě zjištění přesné hmotnosti na povrchu krystalu, je možné ještě určit kvalitativní vlastnosti vrstvy na povrchu krystalu podle doby a charakteristiky dokmitu při snížení napětí. Pokud je vrstva rigidní je dokmit rychlejších než u měkkých viskóznějších vrstev (O'Sullivan and Guilbault, 1999). Tento postup byl například použit pro detekci Salmonella ser. Typhimurium pomocí modifikace krystalu proteinem A a specifickými protilátkami (Babacan et al., 2002).

4.8 Impedanční spektroskopie Impedanční spektroskopie (IS) je technika pro zkoumání vlastností materiálů na základě změn elektrické impedance ve frekvenčním spektru (Janshoff et al., 1996). Nese nejenom informaci o charakteristice materiálu elektrod (vodivost, dielektrická konstanta) ale i o povrchu vnějších rozhraní (kapacitance rozhraní). Metoda IS je založena na měření frekvenčně závislé změny impedance elektrochemického systému. Definice impedance Impedance, jako fyzikální veličina, vyjadřuje zdánlivý elektrický odpor a reaktanci závislý na frekvenci (Barsoukov et al., 2005). Inverzní hodnota impedance je admitance, která vyjadřuje elektrickou vodivost a susceptanci závislou na frekvenci. Impedance je vyjádřena komplexním číslem, protože obsahuje informaci o závislosti dvou veličin. Je označována písmenem Z. Jednotkou impedance je ohm [Ω]. Měření impedance Existují rozdílné přístupy měření hodnoty impedance, které se liší v použitém excitačním signálu. Dva z těchto přístupů se využívá velmi často i v biologických aplikacích (Barsoukov et al., 2005). První a nejčastěji používaný způsob je měření impedance za rozdílných frekvencí pomocí excitace jedno frekvenčního sinusoidního napětí o malé amplitudě a snímání odpovídajícího proudu. Opakování této procedury pro nastavené rozpětí různých frekvencí následně dává impedanční spektrum. Druhým přístup využívá přechodný signál, který je aplikován na elektrochemický systém. Odpověď systému je zaznamenána po celou dobu měření signálu a následně je přeměněn na závislosti odpovědi na frekvenci pomocí Fourierovi transformace. Výsledek obsahuje také informaci o závislosti impedance na použité frekvenci.

36

Použití měření impedance v biologii Pomocí měření impedance je možné například charakterizovat lipidové dvojvrstvy na vodivém povrchu (Janshoff et al., 1996), sledovat transport iontů skrze materiál (Akhavan and Rajabipour, 2013), identifikovat biologické vlastnosti materiálů (Benea, 2013) a v neposlední řadě monitorovat růst mikroorganizmů. Měření impedance lze použít např. při analýze viability a růstu tkáňových kultur v mikrotitrační destičce, kde jsou na dně umístěny zlaté elektrody (Yeon and Park, 2005). Zde je pomocí IS vybrána specifická frekvence a velikost elektrody vhodná pro analýzu. Následně pomocí změn impedance je možné sledovat růstovou křivku a počátek buněčné smrti. Na této metodice měření je založen také systém xCELLigence ze kterého byla využita mikrotitrační destička se zlatými elektrodami. Impedance během růstu buněk se měří na frekvenci 10 kHz nejprve stoupá, dokud nedosáhne stacionární fáze a následně během buněčné smrti pomalu klesá (viz. obrázek č. 7).

Obrázek č. 7: Růstová křivka TK buněk HepG2 během růstu na impedančních detektorech. Dole jsou obrázky pokrytí elektrod při 200x zvětšení. (1) – medium; (2) – lag fáze; (3) – exponenciální fáze; (4) stacionární fáze; (5) fáze buněčné smrti. (převzato (Yeon and Park, 2005)).

37

4.9 Impedanční mikrobiologie (Ur and Brown, 1975)První impedanční měření růstu bakterií byl provedeno v roce 1975 (Ur and Brown, 1975). Byla měřena impedance během růstu bakteriální kultury E. coli při 10 kHz a byl pozorován pokles impedance v závislosti na růstu CFU v roztoku (viz. obrázek č. 8). Ve stejné práci byl také pozorován vliv množství inokula, antibiotik a média na výslednou impedanci. I když zde byly pozorovány určité změny ve sklonu impedanční křivky, tak během růstu bakterií vždy impedance klesala.

Obrázek č. 8: Závislost počtu viabilních E. coli a měřené impedanci na čase. 1 – lag fáze; 2 – exponenciální fáze; 3 – stacionární fáze; 4 -

fáze odumírání; td – limit detekce zvýšení

koncentrace bakterií pomocí měření impedance (převzato; upraveno (Ur and Brown, 1975)). Změna impedance v impedanční mikrobiologii je typicky měřena střídavým proudem při ponoření dvou elektrod do roztoku média s inokulem bakterií. Měření může být provedeno dvěma různými přístupy přímým a nepřímým (Silley and Forsythe, 1996). V přímé metodice měření jsou elektrody v přímém kontaktu s médiem a je měřena změna impedance v čase. Změna impedance během růstu bakterií je hlavně způsobena produkcí metabolitů. Příkladem je vznik 2 molekul kyseliny mléčné z jedné molekuly glukózy. Dalším metabolickým rozkladem může vznikat kyselina uhličitá.

Lepší vodivost metabolitu je založena na zvýšení

množství produktů v roztoku, jejich menší velikostí a v neposlední řadě přítomností náboje (Owicki and Parce, 1992). Dalším zdrojem změn impedance během růstu je průběh iontové výměny skrze buněčnou membránu. Například ionty K+ a Na+ jsou aktivně transportovány skrze membránu pro regulaci membránového potenciálu na membráně a rozdílů osmotického tlaku

38

mezi buňkou a okolím. Tyto iontové procesy způsobují změnu vodivosti média, která je měřenou složkou pro zjištění impedance. Nicméně tyto změny jsou velmi malé a ve srovnání se změnami v důsledku metabolické aktivity bakteriální buňky zanedbatelné. Nepřímá metoda měření impedance je založena na oddělení měřených elektrod od média, kde je kultivován vzorek (Yang and Bashir, 2008). Velmi často jsou elektrody umístěny v roztoku hydroxidu draselného a jsou od kultivačního média odděleny membránou propouštějící plyny. Plynné produkty bakteriálního metabolismu, mezi které patří hlavně CO2, pronikají skrze membránu a jsou absorbovány roztokem hydroxidu draselného. Zde dochází naopak k poklesu vodivosti alkalického roztoku a v důsledku toho k růstu měřené impedance. Během bakteriálního růstu je u typicky měřena pouze reálná složka impedance na jedné frekvenci budícího signálu (viz. níže) v určitých časových intervalech. Typický graf impedance růstové křivky je následně znázorněn na obrázku č.8. Nejdříve je reálná část impedance na začátku měření stálá a pak následně začne klesat. Detekční čas pro zjištění přítomnosti mikroorganizmů v roztoku je závislý na této první ustálené fázi impedančního měření a detekce je většinou signifikantní až koncentrace bakterií v roztoku dosáhne 106 až 107 CFU.ml-1 (Gomez et al., 2002). Následně hodnota reálné složky impedance dosáhne plata, kde je koncentrace bakterií v roztoku 108 CFU.ml-1 a více. V této fázi jsou většinou již všechny metabolity přeměny na konečné produkty. Tvar měřené impedanční křivky velmi dobře koreluje s růstovou křivkou a je zde možné odlišit lag fázi, exponenciální fázi růstu i stacionární fázi. Teoreticky lze z toho uspořádání určit počáteční koncentraci bakterií v závislosti na detekčním čase (Brooks, 1986). Tento vztah by se dal vyjádřit jako: log(C0) = -αtd + β

(5)

kde: CO = počáteční koncentrace buněk td = detekční čas a α i β jsou konstanty spojené s určitým kmenem, použitým médiem a podmínkami kultivace. Detekční čas je většinou od 1 do 8 h. při počáteční koncentraci inokula od 107 do 101 cfu.ml-1 (Gomez et al., 2002). Klasická impedanční mikrobiologie Klasickou impedanční mikrobiologii se určuje hlavně detekce přítomnosti konkrétního druhu bakterií ve vzorku do 24 hodin a určení koncentrace inokula. Jde o soubor metod, které jsou souhrnně velmi podobné klasické mikrobiologii (Brooks, 1986). Nejdříve je nutná správná selekce kultivačního média. Zvolené médium musí podporovat růst zvoleného bakteriálního 39

kmene a přitom musí poskytovat ideální impedanční signály pro vyhodnocení. Měřenou impedanci ovlivňuje hlavně pufrační kapacita média, která brání změnám vodivosti vzorku. Největším úspěchem v této oblasti byl vývoj metodiky pro detekci Salmonella spp. pomocí kultivace v selektivním médium a impedančním měření (Gibson et al., 1992). Tato metoda byla první impedanční metodou, která byla schválena Asociací analytické komunity pro screening potravin na infekci salmonelou. Díky možnosti automatizace bylo vyvinuto i několik komerčně dostupných instrumentací, které využívají metodik klasické impedanční mikrobiologie. Mezi tyto systémy například patří Bactometer (Bio Merieux), The Malthus systems (Malthus Instruments), Rapid Automated Bacterial Impedance Technique (Don Whitley Scientific) a Bac-Trac (Sy-Lab). Tyto systémy jsou velmi často využívány pro stanovení růstových křivek, optimalizaci růstových nebo produkčních médií, určení koncentrace bakterií ve vzorku nebo detekci určitých bakteriálních druhů. Impedance-splitting metodika Většina metod impedanční mikrobiologie je založena na měření vodivosti média za fixní frekvence. Experimentálně bylo ale zjištěno, že měřená bakteriální impedance se skládá ze dvou komponent, které mohou být měřeny za rozdílných rozsahů frekvencí (Hause et al., 1981). První složka byla identifikována jako impedance média a druhá složka jako impedanční příspěvek rozhraní elektrody a elektrolytu (Felice et al., 1999, Felice et al., 1992). Tyto dvě složky lze odlišit pomocí změny frekvence. Bylo pozorováno, že elektrodová impedance se projeví hlavně na frekvencích nižších než 100 Hz a příspěvek složek média k impedanci se projeví nad 5 kHz. Identifikace dvou rozdílných složek impedance vedla k vývoji tzv. impedance-splitting metodiky pro detekcí bakterií (Pless et al., 1994). Na tomto principu je postavena například komerčně dostupná instrumentace od SY-lab, která již dělí měřený výstup na elektrodovou impedanci (E-hodnota) a impedanci média (M-hodnota). Tato instrumentace je mimo jiné využívána například pro detekci Bacillus stearothermophilus (Flint and Brooks, 2001). Ekvivalentní obvod v impedanční mikrobiologii Pomocí náhradního ekvivalentního elektrického obvodu lze velmi dobře popsat impedanci elektrody a impedanci média a frekvenční závislosti jejich příspěvku k celkové impedanci. Pro simulaci měřeného prostředí je dostatečný model jednoduchého elektrického obvodu složeného z rezistoru a dvou kapacitorů zapojených v sérii (viz. obrázek č. 9). Rezistor reprezentuje médium a kapacitory simulují vrstvu bakterií přítomnou na elektrodách (Yang et al.,

40

2003). Výsledné spektrum tohoto teoretického obvodu velmi přesně odpovídá např. naměřenému spektru Salmonella ser. Typhimurium o koncentraci 1,1.103 CFU.ml-1.

Obrázek č. 9: A- typické zapojení dvou elektrodového systému pro měření impedance; B – teoretický obvod modelující praktický systém. RS je rezistor, který reprezentuje odpor média a Cdl je kapacitor, který simuluje rozhraní elektrod. C- srovnání spekter teoretického obvodu a praktického měření S. Typhimurium. Jsou zde vyznačeny i jednotlivé složky impedance dvou vrstvy a rezistoru (převzato (Yang et al., 2003)). Ze zapojení teoretického okruhu lze odvodit funkci impedance systému, kterou lze vyjádřit jako: 1 2 |𝑍| = √𝑅𝑆2 + ( ) 𝜋𝑓𝐶𝑑𝑙

(6)

kde: Z = impedance RS = odpor rezistoru (média) Cdl = kapacita kapacitoru (elektrody) f = frekvence budícího signálu Tato rovnice vysvětluje pokles absolutní hodnoty impedance během růstu bakterie v médiu (Yang and Bashir, 2008). Kdy dochází k poklesu RS a nárůstu Cdl. Pokles Rs je způsoben metabolickou aktivitou bakterií a produkcí malých nabitých metabolitů. Zatímco nárůst kapacity elektrody je způsoben vznikem dvouvrstvy na elektrodě. Hodnota kapacity dvouvrstvy popisuje 41

vrstvu v bezprostřední blízkosti elektrody a je závislá na mnoha faktorech včetně elektrodového potenciálu, teploty, koncentraci iontů a povrchovými vlastnostmi elektrody (jako je drsnost, adsorpce a další). V tomto konkrétním případě kapacitu dvouvrstvy zjednodušeně vyjádřit jako: 𝐶𝑑𝑙 =

𝜀𝑑𝑙 𝐴 𝑑

(7)

kde: εdl = elektrická permitivita dvouvrstvy A = plocha elektrody d = tloušťka dvouvrstvy Elektrická permitivita kromě jiného také odráží přítomnost nabitých molekul v blízkosti elektrody a také roste během metabolické aktivity bakterií.

Výše uvedená rovnice také vysvětluje pozorované dvě složky impedance. Za nízkých frekvencí, menších než 10 kHz je kapacitance dvouvrstvy hlavní složkou měření impedance. Protože je zpravidla impedance dvouvrstvy vysoká a její příspěvek k finální měřené impedanci se snižuje s rostoucí frekvencí je pozorován pokles impedance až do přibližně 10 kHz. Při vyšších frekvencích je složka impedance dvouvrstvy velmi blízká nule a prakticky celý příspěvek impedance je dán odporem média. Použití interdigitated mikroelektrod (IDA) S dalším vývojem bylo navrhnuto využití takových elektrod, jejichž vzdálenost by se co nejvíce blížily velikosti jedné bakterie. Velmi se tomu blíží tzv. interdigitated mikroelektrody, které jsou od sebe vzdálené standardně 10 µm a jsou hřebínkovitého tvaru. Tento typ elektrod se vyznačuje relativně velkou plochou, malým odporem, vysokým podílem signál/šum a využitím malých objemů měřeného roztoku (Stulik et al., 2000). Bylo publikováno již několik studií, které úspěšně využívali IDA elektrody pro monitorování bakteriálního růstu (Paredes et al., 2012). Výše představený teoretický okruh a rovnice výpočtu impedance může být aplikován i na IDA elektrody. Nicméně se zde liší frekvenční rozsahy pro oblast měření média nebo elektrody. Byl pozorován posun typického spektra impedance elektrod do oblastí frekvencí nižších než 100 Hz (klasické elektrody měli tuto oblast nižší než 100 kHz) a impedance média byla charakteristické spektrum posunutu do oblasti 100 Hz do 10kHz. Pomocí simulace ekvivalentního okruhu bylo zjištěno, že k celkové impedanci při použití IDA elektrod přispívá hlavně bakteriální růst na rozhraní elektrod z 30 %, zatímco příspěvek média je zanedbatelný (Yang et al., 2004). U klasických elektrod je tedy měřena hlavně impedance závislá na vodivosti roztoku, zatímco u IDA elektrod je měřena impedance dvouvrstvy elektrody, která je mimo jiné závislá na jejím pokrytí. To je způsobeno hlavně velkým poměrem povrchu IDA elektrod a volné plochy mezi elektrodami. Bakterie má tedy větší šanci uchytit se přímo na elektrodě. 42

Studium biofilmů pomocí impedanční spektroskopie Vlastní analýza vychází ze dvou předpokladů: (i) při adherenci bakterií na povrch elektrod dojde k blokaci přímého toku elektronů mezi elektrodami čímž dojde ke změně impedance (Zikmund et al., 2010) a (ii) metabolické produkty všech viabilních bakterií mění vodivostní charakteristiku roztoku což vede ke změně elektrického odporu a kapacity a následné změně impedance (Paredes et al., 2012). Druhý bod znamená, že při impedanční detekci tvorby biofilmu sledujeme také metabolickou aktivitu bakterií, které nejsou v přímém kontaktu s elektrodou. Bylo zjištěno, že frekvence použití při měření impedance je důležitá pro výběr měřené složky (Radke and Alocilja, 2004). Čím nižší frekvence, tím více měření odráží strukturu bakterií a EPS adherovaných přímo na elektrodách. Větší frekvence proudu při měření impedance zase odráží vlastnosti do roztoku a vyjadřuje spíše vlastní metabolickou aktivitu všech přítomných buněk.

43

5 Praktická část Praktická část byla prováděna v laboratoři Výzkumného ústavu mlékárenského s.r.o. – pobočka Pohořelice a prezentovaná práce tvoří část širšího projektu, který byl rozdělen na tyto úseky: (i) návrh, výroba a kalibrace impedančního spektroskopu, prováděnou studentem VUT Brno Jiřím Sližem (Sliž, 2013) a (ii) návrh vhodných elektrod pro detekci biofilmu a experimentální zjištění závislosti změn IS na přítomnosti biofilmu, který byla provedena Martinem Jakubcem. Dokumenty o kalibraci připraveného impedančního spektroskopu a přesnosti měření jsou uvedeny v příloze. Navrhnutý impedanční spektroskop byl vyzkoušen ve dvou fázích měření. Ve fázi I bylo

kultivováno

10

kmenů

Staphylococcus

epidermidis

na

11.

experimentálních

makroelektrodách různého tvaru v roztoku živného bujónu po dobu tří dnů (viz. níže). Kmeny byly vybrány podle přítomnosti nebo absence ica lokusu, který je hlavním (i když ne jediným) ukazatelem schopnosti tvorby biofilmu. Pět použitých kmenů bylo ica-pozitivní a pět icanegativní. Během kultivace byla měřena reálná a imaginární složka impedance vždy v intervalech 30 minut pro každou elektrodu ve spektru frekvencí od 100 Hz do 10 kHz ve vysokém rozlišení o kroku 100 Hz. Výsledky byly vyhodnoceny grafickou analýzou a selekcí potenciálně zajímavých frekvencí a časů detekce. Ve druhé fázi experimentálního měření byla použita mikrotitrační destička E-plate od Roche s již připravenými mikro elektrodami na dně každé jamky. Tato destička je součástí systému xCELLigence systému od Roche, který využívá měření impedance během růstu tkáňových kultur v čase a identifikaci jejich viability. V této fázi bylo kultivováno 40 kmenů S. epidermidis z nichž polovina byla ica-lokus negativní a druhá polovina ica-lokus pozitivní. Pokus byl proveden ve dvou modifikacích: (i) neupravené dno destičky; (ii) potáhnutí dna destičky mucinem. Mucin na dně destičky má sloužit jako biologická složka částečně simulující střevní prostředí. Měřená spektra jsou vyhodnoceny stejným způsobem jako výsledky z fáze I a kromě toho jsou výsledky z této fázi vyhodnoceny také analýzou hlavních komponent. Dále je určen vliv mucinu na dně jamky na detekci vznikajícího biofilmu.

5.1 Cíle diplomové práce Cíle praktické části diplomové práce jsou: (i) srovnat vhodnost použití různých tvarů elektrod pro impedanční detekci biofilm pozitivních a biofilm negativních kmenů S. epidermidis a identifikace vhodných frekvencí časů pro měření

44

(ii) vyzkoušet navrhnutou metodiku měření na souboru 40 kmenů S. epidermidis při použití upravené mikrotitrační destičky s elektrodami přítomnými na dně mikrotitrační destičky (iii) identifikovat vliv simulované biologické vrstvy na měřené impedanční spektrum

5.2 Materiál a Metodika 5.2.1 Seznam přístrojů Byly použity následující přístroje: centrifuga (Wincom 80-1), termostat (Labo MS, Bt 50), kolébka (Hinotek KJ-201 BS), flowbox (Juan MSC-9) a automatický teploměr (Comet P8510).

Impedance

byla

měřena

pomocí

sestaveného

impedančního

spektroskopu

s multiplexorem (Merebit s.r.o.) založeného na obvodu AD5933 (Analog Service). Nákres a grafy kalibrace jsou uvedeny v příloze.

5.2.2 Seznam chemikálií a médií Byly použity následující chemikálie a média: NaCl (Penta), KCl (Sigma), Na2HPO4.12H2O (Penta), KH2PO4 (Sigma), tryptosójový bujón (Roche), agar (Roche), glukóza (Penta), prasečí mucin (Sigma). Všechny chemikálie byly čistoty p.a.

5.2.3 Bakteriální kmeny a kultivace Na všechny experimenty v první i druhé fázi byly použity kmeny S. epidermidis, u kterých byla již dříve na pracovišti ve Fakultní nemocnici u sv. Anny určena přítomnost nebo absence ica lokusu, který podmiňuje produkci PIA (Ruzicka et al., 2004). Vždy polovina použitých bakteriálních kmenů byla ica negativní a polovina byla ica pozitivní. Všechny kmeny byly před experimentem kultivovány a zpracovány dle následujícího postupu: (i) kultivace 24 hodin / 370C v tryptosójovém bujónu na třepačce (ii) 2 x promytí PBS pufrem (10 000 RCF/15 min) (iii) resuspendace peletu v tryptosojovém bujónu s přidanou 5 % glukózou (Penta) (iv) zředění bakteriálního vzorku na A600 = 0,5

45

Tabulka č. 1: Seznam použitých kmenů S. epidermidis. + označuje kmen s přítomností lokusu ica; - označuje kmen bez ica lokusu. Označení

Tvorba

Označení

Tvorba

Označení

Tvorba

Označení

Tvorba

kmene

biofilmu

kmene

biofilmu

kmene

biofilmu

kmene

biofilmu

E40

-

O4

-

A088

+

L32

+

M44

-

C05

-

A096

+

M21

+

M17

-

L19

-

A057

+

NO2

+

F08

-

L18

-

A023

+

N17B

+

B20

-

L17

-

D12

+

G37

+

D43

-

L15

-

B47

+

G52

+

A002

-

L06

-

C16

+

O5

+

L29

-

L08

-

C33

+

O7

+

M6

-

L03

-

B22

+

O13

+

K12

-

G17

-

L45

+

K11

+

5.2.4 Příprava a modifikace elektrod Ve fázi I bylo použito 11 typů makro elektrod připravených na zakázku firmou APAMA systems s.r.o. podle přiloženého nákresu. Elektrody byly vyrobeny fotocestou z měděné vrstvy na cuprextitu. Přívodní cesty a volná plocha cuprextitu byla ošetřena nevodivým lakem. Plochy elektrod byly následně galvanicky pozlaceny. Byly navrženy různé tvary elektrod s ohledem na vzdálenosti vlastních plošek elektrod a s ohledem na postupné pokrývání kultivační plochy mezi elektrodami biofilmem a snahou sledovat co největší spektrum změn během jeho růstu. Elektrody byly použity opakovaně, maximálně však pětkrát. Očištěny byly vždy pomocí mechanického odstranění biofilmu a aplikací UZ (doplnit) po dobu 16 minut v roztoku 70 % ethanolu. Řádné očištění bylo potvrzeno pod stereoskopem. Po pátém měření bylo již pozorováno významné poškození elektrod a nestálost impedančního signálu v čase a elektrody byly vyměněny za nové. Seznam elektrod a jejich označení je v přiloženém obrázku č. 10.

46

Obrázek č. 10: Nákresy připravených elektrod. Pozlacená byla vždy pouze kontaktní plocha elektrod (nahoře). Ve druhé fázi byla použita mikrotitrační destička E-plate, která je součástí systému xCELLigence od Roche. Každá jamka mikrotitrační destičky obsahuje na dně tzv. interdigitated zlaté elektrody hřebínkovitého tvaru. Elektrody pokrývají přibližně 80 % dna jamky a tvoří velmi významnou plochu na které se může tvořit biofilm. Experiment při měření na E-plate probíhal ve dvou modifikacích: (i) neupravené elektrody a (ii) pokrytí dna jamky mucinem. Mucin zde sloužil model biologické modifikace senzoru. Potáhnutí bylo provedeno podle následující rozpisu (i)

příprava roztoku prasečího mucinu o koncentraci 0,5 mg.ml-1

(ii)

sterilizace mucinu autoklávováním při 121 0C po dobu 20 minut

(iii)

přidání vždy 200 µl roztoku mucinu do mikrotitrační destičky E-plate

(iv)

imobilizace mucinu na povrch destičky při 8 0C po dobu 4 hodin při zvýšené vlhkosti

(v)

jedno jemné promytí jamky mikrotitrační destičky 200 µl PBS

47

Obrázek č. 11: E-plate – mikrotitrační destička s elektrodami na dně každé jamky. Na pravé straně je vyfocen detail elektrody.

5.2.5 Měření impedance Měření impedance probíhalo pomocí sestrojeného impedančního spektroskopu, který byl kalibrován pomocí etalonu -komerčně dostupném impedančním spektroskopu 4594A (Agilent). Směrodatná odchylka kalibrace v celém spektru byla maximálně 0,5%. Impedance byla měřena v rozmezí frekvencí 100 Hz až 100 kHz po dobu 48 hodin v 30minutových intervalech. Krok mezi jednotlivými frekvencemi byl vždy 100 Hz. Celý přístroj byl důvodů konstrukčního řešení umístěn do termostatu a byl temperován na 37 0C. Ve fázi I byla jako měřící cela použita 50 ml zkumavka s 20 ml suspenzí bakterií o A600 = 0,5 v tryptosójovém bujónu s přidanou 5 % glukózou, Do vyříznutého víčka umístěn nosič s 8 elektrodami, vždy 4 na každé straně. Elektrody byly připojeny k multiplexoru, který byl připojen k impedančnímu spektroskopu a počítači. Měřící cela byla umístěna na kolébku (oscilace 20 rpm) v termostatu při 37 0C a byla měřena impedance po dobu 48 hodin. Ve fázi II byla impedance měřena vždy v jednotlivých jamkách mikrotitrační destičky. Mikrotitrační destička byla kontakty spojena se snímací deskou spojenou s multiplexerem, který byl připojen k impedančnímu spektroskopu a počítači. Do každé jamky bylo přidáno 100 µl roztoku TSB a po 8 hodinách kultivace a ustálení signálu bylo přidáno 200 µl bakteriální suspenze o A600 = 0,5. Měření probíhalo v termostatu za statických podmínek při 37 0C a zvýšené vlhkosti, aby došlo k zabránění vyschnutí destičky po dobu dvou dnů.

48

Obrázek č. 12: Zapojení měřící cely ve fázi I (nahoře) a ve fázi II (dole). Kontaktní plocha elektrod je ponořena v bakteriálním roztoku ve zkumavce. Multiplexor určuje, která elektroda je připojena k impedančnímu spektrometru a je ovládáno pomocí počítače. Impedanční spektroskop čte impedanci zrovna připojené elektrody a data odesílá do počítače.

49

5.2.6 Statistické vyhodnocení Všechny měření se opakovali třikrát a pro další vyhodnocení byly použity průměry se všech tří měření. Výsledky byly vyhodnoceny v programech Excel 2013 (Microsoft), Statistica 10 (Statsoft), Origin 7.0 (Origin labs) a MatLab (MathWorks). Grafická analýza fáze I Grafická analýza byla ve fázi I byla provedena dle následujících kroků: (i) byla identifikována zajímavá oblast spektra, kde se odehrávají výrazné změny; (ii) byla sledována změny v průběhu kultivace a byla určena doba nutná pro detekci biofilmu; (iii) sledování změn biofilm pozitivních a biofilm negativních kmenů na jednotlivých typech elektrod. Statistická analýza fáze II Výsledky fáze II byly zpracovány následujícím postupem: (i)

Preprocesing dat pomocí standard normal variate (SNV). Každé spektrum bylo upraveno pomocí následujícího vzorce:

x= (ii)

(𝑥𝑖 −𝑥̅ )

(8)

𝜎

Vyhlazení spekter pomocí Savitsky-Golay filtru. Tento filtr je založen na výpočtu polynomu třetího řádu v dané oblasti spektra a následnou derivací prvního řádu. V tomto případě byl počítán polynom z 21 případů ve spektru.

(iii)

Analýza hlavních komponent s diskriminací analytu (PCA-DA). Diskriminace byla provedena lineární diskriminační analýzou. Spektra z různých času byla zpracována jako jeden lineární po sobě jdoucí celek. Směrodatná odchylka byla počítána dle vzorce: 𝑠2 =

(iv)

∑𝑛𝑖=1( 𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2 𝑛−1

(9)

Analýza pomocí metody parciálních nejmenších čtverců (PLS) podle NIPALS algoritmu (Statistica, Statsoft).

(v)

Validace výsledných modelů PCA-DA a PLS pomocí cross-validation leave one out metody. V této metodě byl vytvořen model na všech naměřených vzorcích kromě jednoho, který byl následně přiřazen dle navrženého modelu. Následně byl postup opakován s vynecháním jiného vzorku a následně byla určena úspěšnost analýzy.

(vi)

Přiřazení neuronovou sítí. Výstup z PLS byl použit pro přiřazení pomocí dopředné vícevrstvé neuronové sítě s jednou skrytou vrstvou se zpětným řízením chyby.

50

5.3 Výsledky a vyhodnocení Ve fázi I bylo měřeno impedanční spektrum každé elektrody v rozmezí od 100 Hz do 10 kHz (krok - 100 Hz) po dobu 48 hodin v 30minutových intervalech. Výsledné množství dat je okolo 20 000 datových údajů pro jednu kombinaci elektrody a kmene. Celkem bylo provedeno 110 experimentů dvojic bakteriální kmen a elektroda a bylo získáno 700 Mb dat. Prvním krokem byla identifikace zajímavých oblastí impedančního spektra vhodných pro další analýzu a určení času, kdy dojde ke změnách impedance spojených s biofilmem. Dále bylo nutné identifikovat, která měřená složka je vhodnější pro analýzu: (i) impedance znázorňující zdánlivý elektrický odpor měřeného prostředí nebo (ii) posunu fáze, která vyjadřuje časový rozdíl period signálu budícího měřenou impedanci a výstupního signálu impedancí ovlivněného. Nejdříve byla vyhodnocena spektrální charakteristika na několika měřených vzorcích a byla určena oblast spektra, kde bylo pozorováno dostatečné množství změn (Graf č. 1 a 2). Následně byla pozorována změna impedance a posunu fáze v čase během kultivace a její změna u biofilm + a – kmenech (Graf 3 až 10). Finálně byl vyhodnocen rozdíl impedancí a posunu fáze při kultivace 8 a 48 hodin na všech typech elektrod (Graf 11 až 30) Analýza dat byla prováděna podle následující postupu: (i) Identifikace vhodného rozsahu frekvencí pro analýzu (ii) Sledování změny spektra v čase (iii) Srovnání b+ a b- kmenů na jednotlivých elektrodách a výběr vhodné veličiny, která odráží vlastnosti biofilmů (iv) Aplikace popsané metody analýzy (selekce frekvence, změn spektra v čase) na 40 bakteriálních kmenů měřených v E-plate

5.3.1 Pokus s makroelektrodami – Fáze I Každá dvojice bakterie – elektroda byla změřena v triplikátech. Dále jsou vyhodnoceny průměrné naměřené hodnoty. Směrodatná odchylka měření nepřesahovala 5%. Identifikace vhodného rozsahu frekvencí pro analýzu Na grafu č. 1 je vidět příklad průběhu naměřeného impedančního spektra sterilního média, biofilm pozitivního a biofilm negativního kmene. Strmě klesající křivka představuje příspěvek kapacitance elektrody a následná mírně klesající křivka vyjadřuje odpor roztoku. Z hlediska detekce biofilmu je tedy zajímavá oblast do přibližně 10 kHz. V této oblasti nastává zlom a s rostoucí frekvencí klesá vliv kapacitance na měřenou impedanci.

51

Graf č. 1: Příklady typických impedančních spekter v měření po 14 a 24 hodinách kultivace. V obou grafech jsou použita data z kultivace kmenů S. epidermidis kmen NO2 (biofilm negativní) a M44 (biofilm pozitivní) na elektrodě A. Jako blank zde bylo použito sterilní TSB médium s přidanou glukózou. Šipkami jsou v grafech znázorněny přibližně oblasti, kde impedance popisuje spíše vznik dvouvrstvy na elektrodě nebo odpor roztoku.

Pokud bude stejný rozsah frekvence vykreslen u měření posunu fáze, dostaneme již velmi rozdílnou křivku zobrazenou v grafu č. 2. Její interpretace je značně složitější, protože zde již nelze tak přesně oddělit vliv elektrody a vliv média na výslednou hodnotu. Záporné hodnoty křivky fáze vyjadřují kapacitní charakter měřeného systému, zatímco hodnoty kladné vyjadřují její indukční charakter (Paredes et al., 2012). Zdá se, že posun fáze ve vyšších frekvencích by se mohl využít pro detekci biofilm pozitivity a biofilm negativity.

52

Graf č. 2: Příklady fázových spekter v měření po 14 a 24 hodinách po inokulaci. V grafu jsou použita data z kultivace kmenů NO2 (biofilm negativní) a M44 (biofilm pozitivní) na elektrodě A.

Pro sledování změn impedance se ukázalo vhodné použít frekvenci do 10 kHz. Při detekci posunu fáze je, ale naopak zajímavé použít frekvence vyšší než 100 kHz, kde se zdá, že biofilm pozitivní kmeny působí pufračně a vyrovnávají změnu fáze během celé doby kultivace. Vzhledem k tomuto pozorování se pro další analýzu zpracovávalo celé frekvenční spektrum. Doba nutná k ustálení signálu V grafu č. 3 a 4 je viditelné počáteční kolísání impedance sterilního média před ustálením signálu. Tento čas odpovídá 450 minutám, což zahrnuje v dané sestavě pravděpodobně temperaci vzorku a vznik iontové dvojvrstvy na rozhraní elektrod, pokrytí zlaté vrstvy bílkovinami v médiu a další nespecifikované jevy probíhající na elektrodách. Tato doba je nezávislá na tvaru elektrody a na použité frekvenci.

53

Graf č. 3 a 4: Stabilita měřené impedance a fáze v čase na vybraných frekvencích. U obou měřených složek – impedance i fáze došlo k ustálení signálu po 450 min. Data jsou z měření roztoku sterilního média na elektrodě C.

Změna impedance v čase a nalezení vhodného časového okna detekce Vhodný čas pro vyhodnocení byl hledán kvůli možnosti zjednodušení analýzy a nalezení pouze určitých časových bodů, které má význam vyhodnotit. Při srovnání změn křivek impedance v čase byl pozorován typický posun impedancí do menších hodnot během růstu biofilmu. Tvar impedanční křivky byl v různých časech velmi podobný. To je pravděpodobně způsobeno snížením odporu kultivačního média způsobenou zvyšováním koncentrace bakterií a jejich metabolických produktů. Ve 24 hodinách kultivace zde dojde k ustálení, to znamená dosažení stacionární fáze růstové křivky. Pokles impedance během kultivace u hodnot frekvence nad 10 kHz ale nemůže být použit jako ukazatel tvorby biofilmu na povrchu elektrody, ale pouze jako ukazatel růstu koncentrace CFU v roztoku.

54

Graf č. 7 až 10: Změny impedance v průběhu kultivace. V grafu jsou data kmene M17 (biofilm negativní) a M21 (biofilm pozitivní) kultivovaného na elektrodě D. Při sledování posunu fáze bylo zjištěno, že s časem kultivace se úhel posunu fáze snižuje. Jak již bylo zmíněno výše i zde byl pozorován pufrační efekt biofilm pozitivních kmenů na změnu fáze během kultivace. K ustálení hodnot fáze došlo, stejně jako u impedance po přibližně 24 hodinách i když zde byly některé kmeny, u kterých došlo k ustálení až po 48 hodinách. U naprosté většiny kmenů došlo k ustálení signálu po 24 hodinách kultivace, kdy pravděpodobně dosáhli v daném provedení stacionární fáze růstové křivky. Vyskytli se zde, ale i případy kdy po 24 hodinách docházelo ještě k ještě výraznějším změnám impedance. Pro další analýzu byla tedy zvolena doba 8 a 48 hodin od začátku kultivace a byla sledována změna impedance a posunu fáze mezi těmito časovými úseky. Srovnání kultivace více kmenů na jednotlivých elektrodách V analýze jednotlivých elektrod byly pozorovány rozdíly ve spektrech impedance a změn fáze na pěti biofilm pozitivních a pěti biofilm negativních kmenech. U jednotlivých elektrod byla srovnávána změna impedance a posunu fáze mezi spektrem v 8 a 48 hodinách. Výsledky jsou uvedeny v grafech č 11 až 32, kde jsou pro přehlednost uvedeny vždy pouze tři kmeny biofilm negativní a tři kmeny biofilm pozitivní. Grafy všech kmenů jsou uvedeny v příloze. 55

Snad nejzajímavějším jevem je velmi velká podobnost výsledků jednotlivých elektrod. Zdá se tedy, že zde nedochází k výraznému vlivu tvaru elektrody na výsledné měření. Biofilm pozitivní a negativní kmeny jsou odlišitelné na všech typech elektrod, kdy biofilm pozitivní kmeny mají velmi podobnou impedanci i změnu fáze v 8 i 48 hodinách. Rozdíl u biofilm pozitivních a negativních kmenů je výraznější při sledování změny fáze. U biofilm pozitivních kmenů se změna posunu fáze za 40 hodin kultivace stálé blíží nule, zatímco u biofilm negativních kmenů zde dochází ke změně až o 150.

56

57

Graf č. 11 až 32: Srovnání jednotlivých elektrod. V každém grafu jsou uvedeny tři kmeny biofilm + a tři kmeny biofilm -. Data znázorňují změnu impedance nebo posunu fáze mezi 8 a 48 hodinami kultivace s odečtením hodnot blanku. Tj. pokud došlo k růstu impedance je zde uvedená hodnota záporná a pokud došlo k poklesu impedance je hodnota v grafu kladná. Pouze elektroda J se výrazněji odlišuje od ostatních poklesem impedance během růstu biofilm negativního kmene. Změna posunu fáze mezi 8 a 48 hodinami u všech použitých elektrod velmi dobře odlišuje biofilm pozitivní a biofilm negativní kmeny.

5.3.2 Vyhodnocení kultivace 40 kmenů S. epidermidis na E-plate – Fáze II U fáze II bylo vyhodnoceno IS až od 500 Hz, kvůli nestálosti měření v nižších frekvencích. Každý kmen byl kultivován v triplikátech. Zde vyhodnocené výsledky jsou průměry tří měření. Směrodatná odchylka nepřesahovala 5 % hodnoty. Srovnání impedančního spektra výsledků z E-platu s výsledky z fáze I a selekce vhodných frekvencí Výsledný naměřená spektra na grafu č. 33 a 34 se významně odlišují od spekter z předchozího měření. Zatímco ve fázi I byl viditelný zlom vlivu kapacitance na měřenou impedanci u 10 kHz zde je tento zlom pozorovatelný již dříve – přibližně u 2 kHz. Také zatímco u fáze I byly viditelné vlivy rozdílné koncentrace bakterií, zde jsou tyto vlivy minimalizovány a hlavně ve vyšších frekvencích se naměřené hodnoty různých jamek zbíhají. I měřená fáze v grafu č. 35 a 36 se odlišuje od předchozích experimentů. Změna posunu fáze je od 2 kHz prakticky lineární, zatímco u experimentů fáze I byl její průběh ve vyšších frekvencích spíše hyperbolický. 58

Pro další analýzu bylo opětovně zvoleno celé spektrum. I když při analýze impedance je zajímavé spektrum pouze do přibližně 2 kHz tak při analýze posunu fáze je pozorovatelná změna v celém spektru i ve vyšších frekvencích.

Graf č. 33 až 36: Spektra změn impedance a posunu fáze při měření kmene S. epidermidis G51 (biofilm negativní) a A096 (biofilm pozitivní).

59

Statistické vyhodnocení E-plate analýzy jamek bez úpravy Statistická analýza výsledků E-platu byla vyhodnocena pouze pro reálnou složku impedance. Posun fáze byl kvůli nejednoznačnosti zkušebních statistických vyhodnocení z analýzy vyřazen. Všechny spektra byla před statistickým vyhodnocením upravena pomocí SNV. Příklad výsledků úpravy je na grafu číslo 37. Touto standardizací bylo dosaženo posunutím průměru do nuly u všech hodnot. Následné odchylky naznačovaly variabilitu v dané frekvenci. Data byla ještě vyhlazena pomocí Savitzky-Golay vyhlazovacím filtrem.

Graf č. 37 : Příklad pre-proccesingu spektra. Následná analýza PCA-DA a PLS ukazuje, že hlavní nositel informace je spektrum do 2 kHz. Zbylé spektrum tvoří velmi malý podíl výsledných faktorů a nese minimum použitelných informací (viz. graf č 38). Faktor 1 je nese z velké části informaci ze spektra naměřeného v 15hodině kultivace. Zatímco faktor 2 je ovlivněn spektrem z 30. hodiny kultivace z naměřených hodnot hned ze začátku experimentu. Během cross-validace vypočítaných modelů byla pozorována maximální úspěšnost přiřazení u použití. V grafu č. 39 je znázorněna nepřesnost vypočítaného modelu pomocí PCA-DA při zahrnutí jednotlivých komponent. Nepřesnost je vyjádřena pomocí středních hodnot reziduí. Vyhodnocení pomocí křížových validací ukázalo větší úspěšnost přiřazení při použití 23 komponent u PLS analýzy (Graf č. 40). Nicméně přesnost se stále pohybovala pouze okolo 70 %. 60

Neuronová síť byla nastavena pro 23 vstupních komponent, 12 vnitřních neuronů a dvou výstupních (biofilm pozitivní a biofilm negativní) a během 4 iterací již dosáhla 93 % úspěšnosti zařazení (viz. graf č. 41).

Graf č. 38: Korelace faktoru 1 a 2 s jednotlivými frekvenčními spektry po 5hodinových intervalech. Příspěvek k faktoru 1 je největší v 15 hodinách kultivace, zatímco k faktoru po 30hodinonách kultivace a v čase 0 při začátku měření.

61

Graf č. 39: Střední hodnoty reziduí v závislosti na počtu použitých komponent u PCA analýzy.

Graf č. 40: Srovnání úspěšného přiřazení jednotlivých modelů při použití různého množství komponent u analýzy jamky bez mucinu. 62

Graf č. 42: Záznam učící křivky neuronové sítě při analýze biofilm pozitivních a negativních kmenů na neupravených elektrodách v E-plate destičce. Srovnání možnosti vyhodnocení při pokrytí dna jamky mucinem Jako model biorekogniční složky bylo dno jamky v jednom modelu experimentu pokrytu mucinem. Následně byly výsledky vyhodnoceny stejným způsobem jako u jamky bez mucinu. To znamená pre-proccesing dat pomocí SNV a vyhlazení pomocí Savitzky-Golay filtru, analýza a PCA a PLS, vyhodnocení věrnosti modelu pomocí cross-validation a tvorba neuronové sítě pro další analýzu PLS skóre. Jak jde vidět na grafu č. 43 je úspěšnost přiřazení u jamek pokrytých mucinem o hodně větší než u nemodifikovaných elektrod. Při použití PLS s 16komponenty již přesahuje přesnost přiřazení 90 %. Při analýze pomocí neuronové sítě s 16vstupními komponenty a 8 vnitřními neurony byla přesnost přiřazení ještě větší a to 98 %.

63

Graf č. 43: Úspěšnost přiřazení při cross-validaci PCA a PLS analýzy elektrod pokrytých mucinem.

64

6 Diskuze Představa automatické detekce tvorby biofilmu v lékařství nebo průmyslu je velmi lákává. Doposud používané metody jsou velmi časově nákladné a výsledky nejsou častou reprodukovatelné. Inovativní přístupy v této oblasti nejsou dostatečně robustní nebo nejsou doposud komerčně dostupné. Měření tvorby biofilmu pomocí impedance se jeví jako vhodný způsob analýzy, ale doposud nebyla popsána přesná metodika detekce biofilmu a nebylo provedeno srovnaní impedančních spekter většího množství biofilm pozitivních a biofilm negativních kmenů. V první fázi praktické části byla analyzována spektra různých kmenů S. epidermidis a byl sledován vliv tvaru elektrod na toto spektrum. Při použití makroelektrod lze pozorované, typické impedanční spektrum rozdělit na dvě oblasti: (i) frekvence nižší než 10 kHz a (ii) frekvence vyšší než 10 kHz. Pro detekci tvorby biofilmu se zdá být zajímavá oblast spektra do 10 kHz, která je především ovlivněna kapacitou elektrod. Výrazné změny impedance během růstu biofilmu byly očekávány v této oblasti. Spektrum v oblastech vyšších jak 10 kHz popisuje rezistenci roztoku, což spíše vyjadřuje měnící se koncentraci bakterií v roztoku. I když byla koncentrace CFU před experimentem upravena na základě měření absorbance a ve všech experimentech byl použit stejný druh – S. epidermidis, přesto oblast spektra nad 10 kHz velmi citlivě odrážela rozdíly počáteční koncentrace bakterií mezi jednotlivými experimenty. Při vložení nové elektrody do sterilního roztoku média bylo pozorováno výrazné kolísání signálu impedance po dobu 450min. Po této době došlo k ustálení signálu. Tato doba je velmi vysoká a odpovídá pravděpodobně době nutné k biologické aktivaci elektrody peptidy přítomnými v použitém živném bujónu. Jednotlivé peptidy se mohou vázat sulfidickými můstky na povrch zlata a tím měnit měřenou impedanci. Dalším vlivem je změna teploty média z 22oC na 37oC, která ale v použitém objemu proběhne během prvních 40 min. Je též možné, že i přes promytí a autoklávování elektrod v deionizované vodě se na elektrodách nacházely rezidua technických kapalin z výroby, popřípadě se vytvořily sraženiny během chladnutí po sterilizaci a během doby ustálení dochází k vymývání těchto složek. Po 450 minutách byl měřený signál u sterilního média již stabilní a lze předpokládat, že v dalších experimentech jsou po této době změny v impedanci způsobené již pouze kultivovanými bakteriemi. V získaných výsledcích individuálních elektrod, i přes pokusy odečíst pozadí od naměřených hodnot jsou údaje o počáteční fázi adherence a tvorby biofilmu jsou zatíženy chybou. Při měření pomocí E-plate tento jev byl na základě předchozích zkušeností eliminován aktivací povrchu před inokulací vlastních bakterií a též byla po celou dobu experimentu zaznamenávána změna teploty, která byla stabilní 65

s odchylkou maximálně 0,05 0C, proto nebyla prováděna korelace hodnot na změnu teploty. V ostatních experimentech, kromě doby ustálení, nebyl vliv teploty zohledněn. Experiment se však nacházel v termostatu o dostatečné tepelné kapacitě, který sloužil pouze pro potřeby tohoto experimentu a nedocházelo ke kolísání teploty vlivem otevírání vstupních dveří. Vliv teploty na impedanci je totiž velmi výrazný a při změně jednoho stupně může dojít ke zvýšení vodivosti média až o 1,9 % (Cady et al., 1978). Během kultivace byl pozorován pokles hodnoty impedance v čase. To samé bylo pozorováno i u změny fáze, kdy čím déle byl vzorek kultivován tím více se posun fáze blížil nule. Při srovnání impedančních křivek fáze byl také u tohoto jevu pozorován výraznější rozdíl mezi biofilm pozitivními a negativními kmeny. Biofilm pozitivní kmeny mají tendenci udržovat změnu fáze přibližně na stejné úrovni po celou dobu kultivace. Stejný efekt byl pozorován u změny impedance kde u biofilm pozitivních kmenů došlo během 40-ti hodin k poklesu vždy maximálně o několik stovek ohmů, zatímco u biofilm negativních kmenů byl tento pokles daleko výraznější a rozdíl dosahoval hodnot jednotek kilo ohmů. Tento pokles je způsoben rostoucí koncentrací bakterií v roztoku a snižováním odporu média. Tento jev se určitě vyskytuje i u biofilm pozitivních kmenů, ale zdá se že biofilm zde částečně blokuje vliv odporu média na měřenou impedanci a maskuje změnu odporu roztoku. „Pufrační efekt“ biofilm pozitivních kmenů se projevoval maskováním změn impedance a fáze v průběhu kultivace. Tento pufrační efekt byl pozorován i na vyšších frekvencích, kde podle vzorce (4) by měl mít povrch elektrody již minimální vliv. Důvod tohoto jevu je neznámý, ale pravděpodobně zde hraje velkou roli „izolace“ povrchu elektrody vznikajícím biofilmem. Vznikající biofilm také ovlivňuje posunem fáze, která může být způsobena zablokováním kapacitního charakteru elektrod. Pufrace posunu fáze je dokonce ještě zřetelnější a zdá se vhodná pro vlastni odlišení biofilm pozitivních a negativních kmenů. Při srovnání všech výsledků měření byl pozorován prakticky minimální vliv tvaru elektrody na dané výsledky. Spektra impedancí i fází byly téměř u všech elektrod velmi podobné. Výjimku tvořila elektroda J, která se vyznačovala odstupujícími elektrodami, kde byl pozorován velký pokles impedance během kultivace, zatímco u jiných elektrod byl pozorován spíše její nárůst. U analýzy E-plate bylo pozorováno několik velmi zajímavých jevů. Celé spektrum reálné složky impedance bylo posunuto více do nižších frekvencí. Zatímco u použitých makroelektrod byla hraniční frekvence, kde se ještě projevovala kapacitance elektrody okolo 10 kHz u E-plate byl tento zlom posunut spíše ke 2kHz. U mikroelektrod se také vůbec neprojevili žádné rozdíly v počáteční koncentraci CFU v médiu. To mohlo být způsobeno kapacitním charakterem elektrody, která pokrývala 80 % dna jamky. 66

Při statistické analýze byla použita pouze reálná složka impedance, protože předběžné výsledky naznačovali, že statistické vyhodnocení změny fáze nemá jednoznačnou interpretaci. Při použití PCA-DA a PLS analýzy byly vytvořeny modely, které měli při použití leave-one-out cross validation nejlepší úspěšnost přiřazení 70 %. Použitá validační metoda je velmi robustní i na takto malém vzorku a výsledná hodnota tedy odpovídá i použití na reálném vzorku. Jako vhodná „simulace“ biorekogniční vrstvy biosenzoru byl zvolen mucin. I když mucin nereaguje specificky s biofilmem jedná se biologickou modifikaci povrchu elektrody a výsledky této analýzy by mohli napomoct při použití jiné biorekogniční vrstvy. Při modifikaci elektrod pomocí prasečího mucinu byla měřené spektra velmi podobná spektrům nemodifikovaných elektrod. Změna byla pozorovatelná až při analýze PCA-DA a PLS. Na rozdíl od nemodifikovaných elektrod byly nevržené modely velmi přesné v určení biofilm pozitivity nebo negativity. Při použití pouhých 16. komponent byla již úspěšnost přiřazení větší než 90 %. Při použití neuronové sítě byla dokonce větší než 95 %. Je tedy zřejmé že vrstva mucinu má určitý vliv na měřené impedanční spektrum a dosud neobjasněným způsobem ovlivňuje měření natolik, že lze velmi snadno odlišit biofilm pozitivní a biofilm negativní kmeny. Tento efekt je ale třeba ověřit na větším vzorku a bylo by vhodné jej srovnat s jinou biorekogniční složkou biosenzoru. Největší vliv na vypočítané komponenty měli časy 0, 15 a 30 hodin kultivace. Z toho je 0 h pravděpodobně pouze určitý šum. Při 15 a 30 hodinách má již na vypočítanou komponentu pravděpodobně vliv i biofilm, ale tento vliv je pozorován maximálně do frekvencí 2 kHz. Nicméně zbývá ještě několik otevřených otázek a možností pro další výzkum. Je nutné potvrdit tyto výsledky na dalších kmenech tvořících biofilm. Dále je nutné ověřit důvod tak dlouhé doby ustálení signálu na vhodně modifikovaných elektrodách. Bylo by též vhodné prozkoumat mechanizmus pufračního efektu tvorby biofilmu na povrchu elektrody a v neposlední řadě vyzkoušet možnost detekce tvorby biofilmu pomocí měření impedance na různých biologicky upravených elektrodách. Tvorba biofilmu byla zkoumána za daných kultivačních podmínek, při jejich změně se výsledky mohou lišit.

67

7 Závěr Během této práce jsme dosáhli těchto výsledků: 1. Tvar zvolených elektrod neměl pozorovatelný vliv na měření impedance v roztoku bakterií. 2. U makroelektrod přítomnost biofilmu snižuje hodnotu impedance a posunu fáze při vyšších frekvencích, čímž se maskuje nárůst koncentrace bakterií v roztoku během kultivace 3. Při použití makroelektrod lze útlumu fáze lze využít pro identifikaci biofilm negativity nebo biofilm pozitivity. 4. U mikroelektrod v E-plate již změna fáze u biofilm pozitivních a negativních kmenů není vhodná pro jejich odlišení. 5. Lze vytvořit model pro rozlišení biofilm pozitivních a negativních kmenů i v E-plate, tento model je založen na neuronové síti a měl by být tedy ozkoušen na podstatně větším vzorku. Přesnost tohoto modelu odlišit biofilm pozitivní a negativní kmeny je 93 %. 6. Při použití mucinu i pouhá PLS analýza dokáže odlišit biofilm + a – kmeny s přesností 90%. Neuronová síť dokáže odlišit biofilm pozitivní a negativní kmeny na mucinu s přesností 98 %. 7. Bylo vyrobeno několik experimentálních makroelektrod. Impedanční spektroskopie lze použít na odlišení biofilm pozitivních a biofilm negativních kmenů. Při použití makroelektrod nebyl pozorován velký vliv tvaru nebo vzdálenosti elektrod a u biofilm pozitivních kmenů je pozorovatelný rozdíl v posunu fáze. U mikroelektrod tato změna pozorovatelná není, ale zase je zde možné využít reálnou složku impedance pro tvorbu modelu zařazení. Tento model je ještě nadále vylepšen pokud je na povrchu elektrody přítomen mucin. Přesný vliv mucinu na výslednou klasifikaci je ale neznámý a musí být dále prozkoumán. Dále byla získána zkušenost se statickým zpracováním velkého množství dat. Byly získány cenné zkušenosti s návrhem a výrobou elektrod. Byla dodána zpětná vazba pro výrobce prototypu impedančního spektroskopu – návrh byl doplněn o kontinuální měření teploty v místě elektrod. Veškeré zkušenosti budou využity v mé další práci.

8 Dedikace Projekt by podpořen grantem MVCR VG20102015023

68

9 Reference AHMED, S., MEGHJI, S., WILLIAMS, R. J., HENDERSON, B., BROCK, J. H. & NAIR, S. P. 2001. Staphylococcus aureus fibronectin binding proteins are essential for internalization by osteoblasts but do not account for differences in intracellular levels of bacteria. Infect Immun, 69, 2872-7. AKHAVAN, A. & RAJABIPOUR, F. 2013. Evaluating ion diffusivity of cracked cement paste using electrical impedance spectroscopy. Materials and Structures, 46, 697-708. ALAVI, M. R., STOJADINOVIC, A. & IZADJOO, M. J. 2012. An overview of biofilm and its detection in clinical samples. Journal of Wound Care, 21, 376-383. ALMEIDA, R. A., MATTHEWS, K. R., CIFRIAN, E., GUIDRY, A. J. & OLIVER, S. P. 1996. Staphylococcus aureus invasion of bovine mammary epithelial cells. Journal of Dairy Science, 79, 1021-1026. ANTIKAINEN, J., ANTON, L., SILLANPAA, J. & KORHONEN, T. K. 2002. Domains in the S-layer protein CbsA of Lactobacillus crispatus involved in adherence to collagens, laminin and lipoteichoic acids and in selfassembly. Molecular Microbiology, 46, 381-394. ARCIOLA, C. R., CAMPOCCIA, D., GAMBERINI, S., CERVELLATI, M., DONATI, E. & MONTANARO, L. 2002. Detection of slime production by means of an optimised Congo red agar plate test based on a colourimetric scale in Staphylococcus epidermidis clinical isolates genotyped for ica locus. Biomaterials, 23, 4233-4239. BABACAN, S., PIVARNIK, P., LETCHER, S. & RAND, A. 2002. Piezoelectric flow injection analysis biosensor for the detection of Salmonella typhimurium. Journal of Food Science, 67, 314-320. BARSOUKOV, EVGENIJ & MCDONALD 2005. Impedance Spectroscopy, John Wiley & Sons. BELLON-FONTAINE, M. N., MOZES, N., VAN DER MEI, H. C., SJOLLEMA, J., CERF, O., ROUXHET, P. G. & BUSSCHER, H. J. 1990. A comparison of thermodynamic approaches to predict the adhesion of dairy microorganisms to solid substrata. Cell Biophys, 17, 93-106. BENEA, L. 2013. Electrochemical Impedance Spectroscopy and Corrosion Behavior of Co/CeO2 Nanocomposite Coatings in Simulating Body Fluid Solution. Metallurgical and Materials Transactions a-Physical Metallurgy and Materials Science, 44A, 1114-1122. BENOIT, M. R., CONANT, C. G., IONESCU-ZANETTI, C., SCHWARTZ, M. & MATIN, A. 2010. New Device for HighThroughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 76, 4136-4142. BOLES, B. R., THOENDEL, M. & SINGH, P. K. 2004. Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 1663016635. BRANCO, R., CRISTOVAO, A. & MORAIS, P. V. 2013. Highly Sensitive, Highly Specific Whole-Cell Bioreporters for the Detection of Chromate in Environmental Samples. Plos One, 8. BRIDIER, A., DUBOIS-BRISSONNET, F., BOUBETRA, A., THOMAS, V. & BRIANDET, R. 2010. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods, 82, 64-70. BROOKS, J. D. 1986. IMPEDANCE MICROBIOLOGY. Food Technology in Australia, 38, 338-340. BROUILLETTE, E., GRONDIN, G., SHKRETA, L., LACASSE, P. & TALBOT, B. G. 2003. In vivo and in vitro demonstration that Staphylococcus aureus is an intracellular pathogen in the presence or absence of fibronectin-binding proteins. Microbial Pathogenesis, 35, 159-168. CADY, P., DUFOUR, S. W., SHAW, J. & KRAEGER, S. J. 1978. ELECTRICAL-IMPEDANCE MEASUREMENTS - RAPID METHOD FOR DETECTING AND MONITORING MICROORGANISMS. Journal of Clinical Microbiology, 7, 265272.

69

CAFISO, V., BERTUCCIO, T., SANTAGATI, M., CAMPANILE, F., AMICOSANTE, G., PERILLI, M. G., SELAN, L., ARTINI, M., NICOLETTI, G. & STEFANI, S. 2004. Presence of the ica operon in clinical isolates of Staphylococcus epidermidis and its role in biofilm production. Clinical Microbiology and Infection, 10, 1081-1088. CAIAZZA, N. C. & O'TOOLE, G. A. 2004. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. Journal of Bacteriology, 186, 4476-4485. CARPENTIER, B. & CERF, O. 1993. BIOFILMS AND THEIR CONSEQUENCES, WITH PARTICULAR REFERENCE TO HYGIENE IN THE FOOD-INDUSTRY. Journal of Applied Bacteriology, 75, 499-511. CERCA, N., PIER, G. B., VILANOVA, M., OLIVEIRA, R. & AZEREDO, J. 2005. Quantitative analysis of adhesion and biofilm formation on hydrophilic and hydrophobic surfaces of clinical isolates of Staphylococcus epidermidis. Research in Microbiology, 156, 506-514. CHAGNOT, C., LISTRAT, A., ASTRUC, T. & DESVAUX, M. 2012. Bacterial adhesion to animal tissues: protein determinants for recognition of extracellular matrix components. Cellular Microbiology, 14, 1687-1696. CHRISTENSEN, G. D., SIMPSON, W. A., BISNO, A. L. & BEACHEY, E. H. 1982. ADHERENCE OF SLIME-PRODUCING STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS-EPIDERMIDIS TO SMOOTH SURFACES. Infection and Immunity, 37, 318-326. CHRISTENSEN, G. D., SIMPSON, W. A., YOUNGER, J. J., BADDOUR, L. M., BARRETT, F. F., MELTON, D. M. & BEACHEY, E. H. 1985. ADHERENCE OF COAGULASE-NEGATIVE STAPHYLOCOCCI TO PLASTIC TISSUE-CULTURE PLATES A QUANTITATIVE MODEL FOR THE ADHERENCE OF STAPHYLOCOCCI TO MEDICAL DEVICES. Journal of Clinical Microbiology, 22, 996-1006. CHRISTNER, M., FRANKE, G. C., SCHOMMER, N. N., WENDT, U., WEGERT, K., PEHLE, P., KROLL, G., SCHULZE, C., BUCK, F., MACK, D., AEPFELBACHER, M. & ROHDE, H. 2010. The giant extracellular matrix-binding protein of Staphylococcus epidermidis mediates biofilm accumulation and attachment to fibronectin. Molecular Microbiology, 75, 187-207. CLARK, L. C. & CLARK, E. W. 1987. A PERSONALIZED HISTORY OF THE CLARK OXYGEN-ELECTRODE. International Anesthesiology Clinics, 25, 1-29. CONRAD, A., KONTRO, M., KEINANEN, M. M., CADORET, A., FAURE, P., MANSUY-HUAULT, L. & BLOCK, J. C. 2003. Fatty acids of lipid fractions in extracellular polymeric substances of activated sludge flocs. Lipids, 38, 1093-1105. CONRADY, D. G., BRESCIA, C. C., HORII, K., WEISS, A. A., HASSETT, D. J. & HERR, A. B. 2008. A zinc-dependent adhesion module is responsible for intercellular adhesion in staphylococcal biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 19456-19461. COSTA, A. R., HENRIQUES, M., OLIVEIRA, R. & AZEREDO, J. 2009. The role of polysaccharide intercellular adhesin (PIA) in Staphylococcus epidermidis adhesion to host tissues and subsequent antibiotic tolerance. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 28, 623-629. COSTERTON, J. W., LEWANDOWSKI, Z., CALDWELL, D. E., KORBER, D. R. & LAPPINSCOTT, H. M. 1995. MICROBIAL BIOFILMS. Annual Review of Microbiology, 49, 711-745. COSTERTON, J. W., LEWANDOWSKI, Z., DEBEER, D., CALDWELL, D., KORBER, D. & JAMES, G. 1994. BIOFILMS, THE CUSTOMIZED MICRONICHE. Journal of Bacteriology, 176, 2137-2142. COSTERTON, J. W., STEWART, P. S. & GREENBERG, E. P. 1999. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science, 284, 1318-1322. CRAMTON, S. E., GERKE, C., SCHNELL, N. F., NICHOLS, W. W. & GOTZ, F. 1999. The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infection and Immunity, 67, 54275433. CUCARELLA, C., SOLANO, C., VALLE, J., AMORENA, B., LASA, I. & PENADES, J. R. 2001. Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation. Journal of Bacteriology, 183, 2888-2896. DAVEY, M. E., CAIAZZA, N. C. & O'TOOLE, G. A. 2003. Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Journal of Bacteriology, 185, 1027-1036. DEBEER, D., STOODLEY, P., ROE, F. & LEWANDOWSKI, Z. 1994. EFFECTS OF BIOFILM STRUCTURES ON OXYGEN DISTRIBUTION AND MASS-TRANSPORT. Biotechnology and Bioengineering, 43, 1131-1138.

70

DOBINSKY, S., BARTSCHT, K. & MACK, D. 2002. Influence of Tn917 insertion on transcription of the icaADBC operon in six biofilm-negative transposon mutants of Staphylococcus epidermidis. Plasmid, 47, 10-17. DUNNE, W. M. & BURD, E. M. 1993. FIBRONECTIN AND PROTEOLYTIC FRAGMENTS OF FIBRONECTIN INTERFERE WITH THE ADHESION OF STAPHYLOCOCCUS-EPIDERMIDIS TO PLASTIC. Journal of Applied Bacteriology, 74, 411416. DURBEEJ, M. 2010. Laminins. Cell and Tissue Research, 339, 259-268. DZYADEVYCH, S. V., ARKHYPOVA, V. N., SOLDATKIN, A. P., EL'SKAYA, A. V., MARTELET, C. & JAFFREZIC-RENAULT, N. 2008. Amperometric enzyme biosensors: Past, present and future. Irbm, 29, 171-180. ELDER, M. J., STAPLETON, F., EVANS, E. & DART, J. K. G. 1995. BIOFILM-RELATED INFECTIONS IN OPHTHALMOLOGY. Eye, 9, 102-109. FELICE, C. J., MADRID, R. E., OLIVERA, J. M., ROTGER, V. I. & VALENTINUZZI, M. E. 1999. Impedance microbiology: quantification of bacterial content in milk by means of capacitance growth curves. Journal of Microbiological Methods, 35, 37-42. FELICE, C. J., VALENTINUZZI, M. E., VERCELLONE, M. I. & MADRID, R. E. 1992. IMPEDANCE BACTERIOMETRY - MEDIUM AND INTERFACE CONTRIBUTIONS DURING BACTERIAL-GROWTH. Ieee Transactions on Biomedical Engineering, 39, 1310-1313. FLEMMING, H. C., NEU, T. R. & WOZNIAK, D. J. 2007. The EPS matrix: The "House of Biofilm cells". Journal of Bacteriology, 189, 7945-7947. FLEMMING, H. C. & WINGENDER, J. 2010. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology, 8, 623-633. FLINT, S. H. & BROOKS, J. D. 2001. Rapid detection of Bacillus stearothermophilus using impedance-splitting. Journal of Microbiological Methods, 44, 205-208. FOWLER, T., WANN, E. R., JOH, D., JOHANSSON, S., FOSTER, T. J. & HOOK, M. 2000. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. Eur J Cell Biol, 79, 672-9. FRANKLIN, M. J. & OHMAN, D. E. 1996. Identification of algI and algJ in the Pseudomonas aeruginosa alginate biosynthetic gene cluster which are required for alginate O acetylation. Journal of Bacteriology, 178, 21862195. FREEMAN, D. J., FALKINER, F. R. & KEANE, C. T. 1989. NEW METHOD FOR DETECTING SLIME PRODUCTION BY COAGULASE NEGATIVE STAPHYLOCOCCI. Journal of Clinical Pathology, 42, 872-874. FROLUND, B., PALMGREN, R., KEIDING, K. & NIELSEN, P. H. 1996. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Research, 30, 1749-1758. GARNY, K., HORN, H. & NEU, T. R. 2008. Interaction between biofilm development, structure and detachment in rotating annular reactors. Bioprocess and Biosystems Engineering, 31, 619-629. GEOGHEGAN, J. A., CORRIGAN, R. M., GRUSZKA, D. T., SPEZIALE, P., O'GARA, J. P., POTTS, J. R. & FOSTER, T. J. 2010. Role of Surface Protein SasG in Biofilm Formation by Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology, 192, 5663-5673. GERKE, C., KRAFT, A., SUSSMUTH, R., SCHWEITZER, O. & GOTZ, F. 1998. Characterization of the Nacetylglucosaminyltransferase activity involved in the biosynthesis of the Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesin. Journal of Biological Chemistry, 273, 18586-18593. GIBSON, D. M., COOMBS, P. & PIMBLEY, D. W. 1992. AUTOMATED CONDUCTANCE METHOD FOR THE DETECTION OF SALMONELLA IN FOODS - COLLABORATIVE STUDY. Journal of Aoac International, 75, 293-302. GOMEZ, R., BASHIR, R. & BHUNIA, A. K. 2002. Microscale electronic detection of bacterial metabolism. Sensors and Actuators B-Chemical, 86, 198-208. GRACIA, E., FERNANDEZ, A., CONCHELLO, P., LACLERIGA, A., PANIAGUA, L., SERAL, F. & AMORENA, B. 1997. Adherence of Staphylococcus aureus slime-producing strain variants to biomaterials used in orthopaedic surgery. International Orthopaedics, 21, 46-51.

71

HALL-STOODLEY, L., COSTERTON, J. W. & STOODLEY, P. 2004. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology, 2, 95-108. HAUSE, L. L., KOMOROWSKI, R. A. & GAYON, F. 1981. ELECTRODE AND ELECTROLYTE IMPEDANCE IN THE DETECTION OF BACTERIAL-GROWTH. Ieee Transactions on Biomedical Engineering, 28, 403-410. HENDERSON, B., NAIR, S., PALLAS, J. & WILLIAMS, M. A. 2011. Fibronectin: a multidomain host adhesin targeted by bacterial fibronectin-binding proteins. Fems Microbiology Reviews, 35, 147-200. HERRMANN, M., VAUDAUX, P. E., PITTET, D., AUCKENTHALER, R., LEW, P. D., SCHUMACHERPERDREAU, F., PETERS, G. & WALDVOGEL, F. A. 1988. FIBRONECTIN, FIBRINOGEN, AND LAMININ ACT AS MEDIATORS OF ADHERENCE OF CLINICAL STAPHYLOCOCCAL ISOLATES TO FOREIGN MATERIAL. Journal of Infectious Diseases, 158, 693701. HOIBY, N., BJARNSHOLT, T., GIVSKOV, M., MOLIN, S. & CIOFU, O. 2010. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35, 322-332. HOLLAND, L. M., CONLON, B. & O'GARA, J. P. 2011. Mutation of tagO reveals an essential role for wall teichoic acids in Staphylococcus epidermidis biofilm development. Microbiology-Sgm, 157, 408-418. HORKA, M., RUZICKA, F., HOLA, V. & SLAIS, K. 2005. Dynamic modification of microorganisms by pyrenebutanoate for fluorometric detection in capillary zone electrophoresis. Electrophoresis, 26, 548-555. HUDSON, M. C., RAMP, W. K., NICHOLSON, N. C., WILLIAMS, A. S. & NOUSIAINEN, M. T. 1995. Internalization of Staphylococcus aureus by cultured osteoblasts. Microbial Pathogenesis, 19, 409-419. IZANO, E. A., AMARANTE, M. A., KHER, W. B. & KAPLAN, J. B. 2008. Differential roles of poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide and extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 74, 470-476. JANSHOFF, A., WEGENER, J., STEINEM, C., SIEBER, M. & GALLA, H. J. 1996. Applications of impedance spectroscopy in biochemistry and biophysics. Acta Biochimica Polonica, 43, 339-348. JONSSON, K., SIGNAS, C., MULLER, H. P. & LINDBERG, M. 1991. Two different genes encode fibronectin binding proteins in Staphylococcus aureus. The complete nucleotide sequence and characterization of the second gene. Eur J Biochem, 202, 1041-8. JUCKER, B. A., HARMS, H. & ZEHNDER, A. J. B. 1996. Adhesion of the positively charged bacterium Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and teflon. Journal of Bacteriology, 178, 5472-5479. KEANE, F. M., LOUGHMAN, A., VALTULINA, V., BRENNAN, M., SPEZIALE, P. & FOSTER, T. J. 2007. Fibrinogen and elastin bind to the same region within the A domain of fibronectin binding protein A, an MSCRAMM of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology, 63, 711-723. KIM, J., PARK, H. D. & CHUNG, S. 2012. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules, 17, 98189834. KNOBLOCH, J. K. M., HORSTKOTTE, M. A., ROHDE, H. & MACK, D. 2002. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in Staphylococcus aureus. Medical Microbiology and Immunology, 191, 101-106. KORSTGENS, V., FLEMMING, H. C., WINGENDER, J. & BORCHARD, W. 2001. Influence of calcium ions on the mechanical properties of a model biofilm of mucoid Pseudomonas aeruginosa. Water Science and Technology, 43, 49-57. LASA, I. & PENADES, J. R. 2006. Bap: A family of surface proteins involved in biofilm formation. Research in Microbiology, 157, 99-107. LAUER, P., RINAUDO, C. D., SORIANI, M., MARGARIT, I., MAIONE, D., ROSINI, R., TADDEI, A. R., MORA, M., RAPPUOLI, R., GRANDI, G. & TELFORD, J. L. 2005. Genome analysis reveals pili in group B Streptococcus. Science, 309, 105-105. LAWRENCE, J. R. & NEU, T. R. 1999. Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms. Biofilms, 310, 131-144.

72

LAWRENCE, J. R., SWERHONE, G. D. W., KUHLICKE, U. & NEU, T. R. 2007. In situ evidence for microdomains in the polymer matrix of bacterial microcolonies. Canadian Journal of Microbiology, 53, 450-458. LECK, C. & BIGG, E. K. 2005. Biogenic particles in the surface microlayer and overlaying atmosphere in the central Arctic Ocean during summer. Tellus Series B-Chemical and Physical Meteorology, 57, 305-316. LECUYER, S., RUSCONI, R., SHEN, Y., FORSYTH, A., VLAMAKIS, H., KOLTER, R. & STONE, H. A. 2011. Shear Stress Increases the Residence Time of Adhesion of Pseudomonas aeruginosa. Biophysical Journal, 100, 341-350. LEE, J. H., KAPLAN, J. B. & LEE, W. Y. 2008. Microfluidic devices for studying growth and detachment of Staphylococcus epidermidis biofilms. Biomedical Microdevices, 10, 489-498. LI, X. H., MA, H. M., DONG, S. Y., DUAN, X. J. & LIANG, S. C. 2004. Selective labeling of histidine by a designed fluorescein-based probe. Talanta, 62, 367-371. LINDAHL, M., HOLMBERG, O. & JONSSON, P. 1990. Adhesive proteins of haemagglutinating Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. J Gen Microbiol, 136, 935-9. LIZCANO, A., SANCHEZ, C. J. & ORIHUELA, C. J. 2012. A role for glycosylated serine-rich repeat proteins in Grampositive bacterial pathogenesis. Molecular Oral Microbiology, 27, 257-269. LOS, R., SAWICKI, R., JUDA, M., STANKEVIC, M., RYBOJAD, P., SAWICKI, M., MALM, A. & GINALSKA, G. 2010. A comparative analysis of phenotypic and genotypic methods for the determination of the biofilm-forming abilities of Staphylococcus epidermidis. Fems Microbiology Letters, 310, 97-103. LOUGHMAN, A., SWEENEY, T., KEANE, F. M., PIETROCOLA, G., SPEZIALE, P. & FOSTER, T. J. 2008. Sequence diversity in the A domain of Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein A. Bmc Microbiology, 8. LOWY, F. D., FANT, J., HIGGINS, L. L., OGAWA, S. K. & HATCHER, V. B. 1988. STAPHYLOCOCCUS-AUREUS - HUMANENDOTHELIAL CELL-INTERACTIONS. Journal of Ultrastructure and Molecular Structure Research, 98, 137146. MACK, D., FISCHER, W., KROKOTSCH, A., LEOPOLD, K., HARTMANN, R., EGGE, H. & LAUFS, R. 1996. The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis is a linear beta-1,6-linked glucosaminoglycan: Purification and structural analysis. Journal of Bacteriology, 178, 175-183. MACK, D., NEDELMANN, M., KROKOTSCH, A., SCHWARZKOPF, A., HEESEMANN, J. & LAUFS, R. 1994. CHARACTERIZATION OF TRANSPOSON MUTANTS OF BIOFILM-PRODUCING STAPHYLOCOCCUSEPIDERMIDIS IMPAIRED IN THE ACCUMULATIVE PHASE OF BIOFILM PRODUCTION - GENETIC IDENTIFICATION OF A HEXOSAMINE-CONTAINING POLYSACCHARIDE INTERCELLULAR ADHESIN. Infection and Immunity, 62, 3244-3253. MAO, H. B., CREMER, P. S. & MANSON, M. D. 2003. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100, 5449-5454. MARSHALL, K. C. 1992. ADHESION OF MARINE-BACTERIA - A CITATION-CLASSIC COMMENTARY ON MECHANISM OF THE INITIAL EVENTS IN THE SORPTION OF MARINE-BACTERIA TO SURFACES BY MARSHALL,K.C., STOUT,R., AND MITCHELL,R. Current Contents/Agriculture Biology & Environmental Sciences, 8-8. MATHUR, T., SINGHAL, S., KHAN, S., UPADHYAY, D. J., FATMA, T. & RATTAN, A. 2006. Detection of biofilm formation among the clinical isolates of Staphylococci: an evaluation of three different screening methods. Indian J Med Microbiol, 24, 25-9. MERINO, N., TOLEDO-ARANA, A., VERGARA-IRIGARAY, M., VALLE, J., SOLANO, C., CALVO, E., LOPEZ, J. A., FOSTER, T. J., PENADES, J. R. & LASA, I. 2009. Protein A-Mediated Multicellular Behavior in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology, 191, 832-843. MERRITT, J. H., KADOURI, D. E. & O'TOOLE, G. A. 2005. Growing and Analyzing Static Biofilms. Current Protocols in Microbiology. John Wiley & Sons, Inc. MOHAMED, N., TEETERS, M. A., PATTI, J. M., HOOK, M. & ROSS, J. M. 1999. Inhibition of Staphylococcus aureus adherence to collagen under dynamic conditions. Infection and Immunity, 67, 589-594. MOHLE, R. B., LANGEMANN, T., HAESNER, M., AUGUSTIN, W., SCHOLL, S., NEU, T. R., HEMPEL, D. C. & HORN, H. 2007. Structure and shear strength of microbial biofilms as determined with confocal laser scanning microscopy

73

and fluid dynamic gauging using a novel rotating disc biofilm reactor. Biotechnology and Bioengineering, 98, 747-755. MOLIN, S. & TOLKER-NIELSEN, T. 2003. Gene transfer occurs with enhanced efficiency in biofilms and induces enhanced stabilisation of the biofilm structure. Current Opinion in Biotechnology, 14, 255-261. MOLOBELA, I. P. & ILUNGA, F. M. 2012. Impact of bacterial biofilms: the importance of quantitative biofilm studies. Annals of Microbiology, 62, 461-467. MONGODIN, E., BAJOLET, O., CUTRONA, J., BONNET, N., DUPUIT, F., PUCHELLE, E. & DE BENTZMANN, S. 2002. Fibronectin-binding proteins of Staphylococcus aureus are involved in adherence to human airway epithelium. Infection and Immunity, 70, 620-630. MONTANARO, L., SPEZIALE, P., CAMPOCCIA, D., RAVAIOLI, S., CANGINI, I., PIETROCOLA, G., GIANNINI, S. & ARCIOLA, C. R. 2011. Scenery of Staphylococcus implant infections in orthopedics. Future Microbiology, 6, 1329-1349. MOYO, M., OKONKWO, J. O. & AGYEI, N. M. 2012. Recent Advances in Polymeric Materials Used as Electron Mediators and Immobilizing Matrices in Developing Enzyme Electrodes. Sensors, 12, 923-953. MOZES, N. & ROUXHET, P. G. 1987. METHODS FOR MEASURING HYDROPHOBICITY OF MICROORGANISMS. Journal of Microbiological Methods, 6, 99-112. MUIZNIEKS, L. D., WEISS, A. S. & KEELEY, F. W. 2010. Structural disorder and dynamics of elastin. Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire, 88, 239-250. MULCAHY, H., CHARRON-MAZENOD, L. & LEWENZA, S. 2008. Extracellular DNA Chelates Cations and Induces Antibiotic Resistance in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Plos Pathogens, 4. NALLAPAREDDY, S. R., WEINSTOCK, G. M. & MURRAY, B. E. 2003. Clinical isolates of Enterococcus faecium exhibit strain-specific collagen binding mediated by Acm, a new member of the MSCRAMM family. Molecular Microbiology, 47, 1733-1747. NANDURI, V., BHUNIA, A. K., TU, S. I., PAOLI, G. C. & BREWSTER, J. D. 2007. SPR biosensor for the detection of Lmonocytogenes using phage-displayed antibody. Biosensors & Bioelectronics, 23, 248-252. NASHEV, D., TOSHKOVA, K., SALASIA, S. I. O., HASSAN, A. A., LAMMLER, C. & ZSCHOCK, M. 2004. Distribution of virulence genes of Staphylococcus aureus isolated from stable nasal carriers. Fems Microbiology Letters, 233, 45-52. NEWMAN, J. D. & TURNER, A. P. F. 2005. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosensors & Bioelectronics, 20, 2435-2453. NUZZO, I., SANGES, M. R., FOLGORE, A. & CARRATELLI, C. R. 2000. Apoptosis of human keratinocytes after bacterial invasion. Fems Immunology and Medical Microbiology, 27, 235-240. O'GARA, J. P. 2007. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. Fems Microbiology Letters, 270, 179-188. O'NEILL, E., POZZI, C., HOUSTON, P., HUMPHREYS, H., ROBINSON, D. A., LOUGHMAN, A., FOSTER, T. J. & O'GARA, J. P. 2008. A novel Staphylococcus aureus biofilm phenotype mediated by the fibronectin-binding proteins, FnBPA and FnBPB. Journal of Bacteriology, 190, 3835-3850. O'SULLIVAN, C. K. & GUILBAULT, G. G. 1999. Commercial quartz crystal microbalances - theory and applications. Biosensors & Bioelectronics, 14, 663-670. OLIVEIRA, A. & CUNHA MDE, L. 2010. Comparison of methods for the detection of biofilm production in coagulasenegative staphylococci. BMC Res Notes. England. OTZEN, D. & NIELSEN, P. H. 2008. We find them here, we find them there: Functional bacterial amyloid. Cellular and Molecular Life Sciences, 65, 910-927. OWICKI, J. C. & PARCE, J. W. 1992. BIOSENSORS BASED ON THE ENERGY-METABOLISM OF LIVING CELLS - THE PHYSICAL-CHEMISTRY AND CELL BIOLOGY OF EXTRACELLULAR ACIDIFICATION. Biosensors & Bioelectronics, 7, 255-272.

74

PALEČEK, E. 1996. From Polarography of DNA to Microanalysis with Nucleic Acid-Modified Electrodes. Electroanalysis, 8, 7-14. PALMER, R. J. & STERNBERG, C. 1999. Modern microscopy in biofilm research: confocal microscopy and other approaches. Current Opinion in Biotechnology, 10, 263-268. PANKOV, R. & YAMADA, K. M. 2002. Fibronectin at a glance. Journal of Cell Science, 115, 3861-3863. PAREDES, J., BECERRO, S., ARIZTI, F., AGUINAGA, A., DEL POZO, J. L. & ARANA, S. 2012. Real time monitoring of the impedance characteristics of Staphylococcal bacterial biofilm cultures with a modified CDC reactor system. Biosensors & Bioelectronics, 38, 226-232. PARK, P. W., BROEKELMANN, T. J., MECHAM, B. R. & MECHAM, R. P. 1999. Characterization of the elastin binding domain in the cell-surface 25-kDa elastin-binding protein of Staphylococcus aureus (EbpS). Journal of Biological Chemistry, 274, 2845-2850. PATTI, J. M., ALLEN, B. L., MCGAVIN, M. J. & HOOK, M. 1994. MSCRAMM-MEDIATED ADHERENCE OF MICROORGANISMS TO HOST TISSUES. Annual Review of Microbiology, 48, 585-617. PEACOCK, S. J., FOSTER, T. J., CAMERON, B. J. & BERENDT, A. R. 1999. Bacterial fibronectin-binding proteins and endothelial cell surface fibronectin mediate adherence of Staphylococcus aureus to resting human endothelial cells. Microbiology-Uk, 145, 3477-3486. PIETROCOLA, G., VALTULINA, V., RINDI, S., JOST, B. H. & SPEZIALE, P. 2007. Functional and structural properties of CbpA, a collagen-binding protein from Arcanobacterium pyogenes. Microbiology-Sgm, 153, 3380-3389. PLESS, P., FUTSCHIK, K. & SCHOPF, E. 1994. RAPID DETECTION OF SALMONELLAE BY MEANS OF A NEW IMPEDANCESPLITTING METHOD. Journal of Food Protection, 57, 369-376. PROCHÁZKOVÁ, G., JIRKŮ, V., BARTOVSKÁ, L. & BRÁNYIK, T. 2011. POUŽITÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH NÁSTROJŮ PRO PREDIKCI MIKROBIÁLNÍ ADHEZE. Chemické listy. PYBURN, T. M., BENSING, B. A., XIONG, Y. Q., MELANCON, B. J., TOMASIAK, T. M., WARD, N. J., YANKOVSKAYA, V., OLIVER, K. M., CECCHINI, G., SULIKOWSKI, G. A., TYSKA, M. J., SULLAM, P. M. & IVERSON, T. M. 2011. A Structural Model for Binding of the Serine-Rich Repeat Adhesin GspB to Host Carbohydrate Receptors. Plos Pathogens, 7. RADKE, S. M. & ALOCILJA, E. C. 2004. Design and fabrication of a microimpedance biosensor for bacterial detection. Ieee Sensors Journal, 4, 434-440. RICARD-BLUM, S. 2011. The Collagen Family. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 3. ROCHEX, A., GODON, J. J., BERNET, N. & ESCUDIE, R. 2008. Role of shear stress on composition, diversity and dynamics of biofilm bacterial communities. Water Research, 42, 4915-4922. ROHDE, H., BURDELSKI, C., BARTSCHT, K., HUSSAIN, M., BUCK, F., HORSTKOTTE, M. A., KNOBLOCH, J. K. M., HEILMANN, C., HERRMANN, M. & MACK, D. 2005. Induction of Staphylococcus epidermidis biofilm formation via proteolytic processing of the accumulation-associated protein by staphylococcal and host proteases. Molecular Microbiology, 55, 1883-1895. RUPP, M. E., ULPHANI, J. S., FEY, P. D., BARTSCHT, K. & MACK, D. 1999. Characterization of the importance of polysaccharide intercellular adhesin/hemagglutinin of Staphylococcus epidermidis in the pathogenesis of biomaterial-based infection in a mouse foreign body infection model. Infection and Immunity, 67, 26272632. RUZICKA, F., HOLA, V., VOTAVA, M., TEJKALOVA, R., HORVAT, R., HEROLDOVA, M. & WOZNICOVA, V. 2004. Biofilm detection and the clinical significance of Staphylococcus epidermidis isolates. Folia Microbiologica, 49, 596600. RUZICKA, F., HORKA, M., HOLA, V. & VOTAVA, M. 2007. Capillary Isoelectric Focusing - Useful tool for detection of the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis. Journal of Microbiological Methods, 68, 530-535. RŮŽIČKA, F., HOLÁ, V. & VOTAVA, M. 2006. Možnosti průkazu tvorby biofilmu v rutinní mikrobiologické praxi. Epidemiologie, mikrobiologie, imunologie: Česká lékařská společnost J. E. Purkyně.

75

SADOVSKAYA, I., VINOGRADOV, E., FLAHAUT, S., KOGAN, G. & JABBOURI, S. 2005. Extracellular carbohydratecontaining polymers of a model biofilm-producing strain, Staphylococcus epidermidis RP62A. Infection and Immunity, 73, 3007-3017. SALEK, M. M., JONES, S. M. & MARTINUZZI, R. J. 2009. The influence of flow cell geometry related shear stresses on the distribution, structure and susceptibility of Pseudomonas aeruginosa 01 biofilms. Biofouling, 25, 711725. SANDIG, H., MCDONALD, J., GILMOUR, J., ARNO, M., LEE, T. H. & COUSINS, D. J. 2009. Fibronectin is a TH1-specific molecule in human subjects. J Allergy Clin Immunol. United States. SCHOOLING, S. R. & BEVERIDGE, T. J. 2006. Membrane vesicles: an overlooked component of the matrices of biofilms. Journal of Bacteriology, 188, 5945-5957. SCHRODER, A., SCHRODER, B., ROPPENSER, B., LINDER, S., SINHA, B., FASSLER, R. & AEPFELBACHER, M. 2006. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Molecular Biology of the Cell, 17, 5198-5210. SCHROEDER, K., JULARIC, M., HORSBURGH, S. M., HIRSCHHAUSEN, N., NEUMANN, C., BERTLING, A., SCHULTE, A., FOSTER, S., KEHREL, B. E., PETERS, G. & HEILMANN, C. 2009. Molecular Characterization of a Novel Staphylococcus Aureus Surface Protein (SasC) Involved in Cell Aggregation and Biofilm Accumulation. Plos One, 4. SCHWARZ-LINEK, U., HOOK, M. & POTTS, J. R. 2006. Fibronectin-binding proteins of Gram-positive cocci. Microbes and Infection, 8, 2291-2298. SHEN, L., LU, Y. H. & LIU, Y. 2012. Mathematical modeling of biofilm-covered granular activated carbon: a review. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 87, 1513-1520. SHINJI, H., KAMADA, M., SEKI, K., TAJIMA, A., IWASE, T. & MASUDA, S. 2007. Expression and distribution of very late antigen-5 in mouse peritoneal macrophages upon ingestion of fibronectin-bound Staphylococcus aureus. Microbiology and Immunology, 51, 63-71. SHINJI, H., SAKURADA, J., SEKI, K., MURAI, M. & MASUDA, S. 1998. Different effects of fibronectin on the phagocytosis of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci by murine peritoneal macrophages. Microbiology and Immunology, 42, 851-861. SHIVSHANKAR, P., SANCHEZ, C., ROSE, L. F. & ORIHUELA, C. J. 2009. The Streptococcus pneumoniae adhesin PsrP binds to Keratin 10 on lung cells. Molecular Microbiology, 73, 663-679. SIGNAS, C., RAUCCI, G., JONSSON, K., LINDGREN, P. E., ANANTHARAMAIAH, G. M., HOOK, M. & LINDBERG, M. 1989. NUCLEOTIDE-SEQUENCE OF THE GENE FOR A FIBRONECTIN-BINDING PROTEIN FROM STAPHYLOCOCCUSAUREUS - USE OF THIS PEPTIDE SEQUENCE IN THE SYNTHESIS OF BIOLOGICALLY-ACTIVE PEPTIDES. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 699-703. SILLEY, P. & FORSYTHE, S. 1996. Impedance microbiology - A rapid change for microbiologists. Journal of Applied Bacteriology, 80, 233-243. SKLADAL, P. 2003. Piezoelectric quartz crystal sensors applied for bioanalytical assays and characterization of affinity interactions. Journal of the Brazilian Chemical Society, 14, 491-502. SKOLIMOWSKI, M., NIELSEN, M. W., EMNEUS, J., MOLIN, S., TABORYSKI, R., STERNBERG, C., DUFVA, M. & GESCHKE, O. 2010. Microfluidic dissolved oxygen gradient generator biochip as a useful tool in bacterial biofilm studies. Lab on a Chip, 10, 2162-2169. SLIŽ, J. 2013. Impedanční spektroskop. Bachelor's, Vysoké učení technické v Brně. STEPANOVIC, S., VUKOVIC, D., DAKIC, I., SAVIC, B. & SVABIC-VLAHOVIC, M. 2000. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. Journal of Microbiological Methods, 40, 175-179. STULIK, K., AMATORE, C., HOLUB, K., MARECEK, V. & KUTNER, W. 2000. Microelectrodes. Definitions, characterization, and applications (Technical Report). Pure and Applied Chemistry, 72, 1483-1492. SUTHERLAND, I. W. 2001. The biofilm matrix - an immobilized but dynamic microbial environment. Trends in Microbiology, 9, 222-227.

76

TAKAMATSU, D., BENSING, B. A., PRAKOBPHOL, A., FISHER, S. J. & SULLAM, P. M. 2006. Binding of the streptococcal surface glycoproteins GspB and Hsa to human salivary proteins. Infection and Immunity, 74, 1933-1940. TIELEN, P., STRATHMANN, M., JAEGER, K. E., FLEMMING, H. C. & WINGENDER, J. 2005. Alginate acetylation influences initial surface colonization by mucoid Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research, 160, 165-176. TOLKER-NIELSEN, T., BRINCH, U. C., RAGAS, P. C., ANDERSEN, J. B., JACOBSEN, C. S. & MOLIN, S. 2000. Development and dynamics of Pseudomonas sp biofilms. Journal of Bacteriology, 182, 6482-6489. TORMO, M. A., KNECHT, E., GOTZ, F., LASA, M. & PENADES, J. R. 2005. Bap-dependent biofilm formation by pathogenic species of Staphylococcus: evidence of horizontal gene transfer? Microbiology-Sgm, 151, 2465-2475. TYAN, Y. C., YANG, M. H., CHUNG, T. W., CHEN, W. C., WANG, M. C., CHEN, Y. L., HUANG, S. L., HUANG, Y. F. & JONG, S. B. 2011. Characterization of surface modification on self-assembled monolayer-based piezoelectric crystal immunosensor for the quantification of serum alpha-fetoprotein. Journal of Materials ScienceMaterials in Medicine, 22, 1383-1391. UDE, S., ARNOLD, D. L., MOON, C. D., TIMMS-WILSON, T. & SPIERS, A. J. 2006. Biofilm formation and cellulose expression among diverse environmental Pseudomonas isolates. Environmental Microbiology, 8, 19972011. UR, A. & BROWN, D. F. J. 1975. IMPEDANCE MONITORING OF BACTERIAL ACTIVITY. Journal of Medical Microbiology, 8, 19-28. VAN OSS, C. J., CHAUDHURY, M. K. & GOOD, R. J. 1987. Monopolar surfaces. Adv Colloid Interface Sci, 28, 35-64. VAN OSS, C. J., GOOD, R. J. & CHAUDHURY, M. K. 1986. The role of van der Waals forces and hydrogen bonds in “hydrophobic interactions” between biopolymers and low energy surfaces. Journal of Colloid and Interface Science, 111, 378-390. VERWEY, E. J. W. 1947. Theory of the Stability of Lyophobic Colloids. The Journal of Physical and Colloid Chemistry, 51, 631-636. VUONG, C., KOCIANOVA, S., VOYICH, J. M., YAO, Y. F., FISCHER, E. R., DELEO, F. R. & OTTO, M. 2004. A crucial role for exopolysaccharide modification in bacterial biofilm formation, immune evasion, and virulence. Journal of Biological Chemistry, 279, 54881-54886. WAGNER, M., IVLEVA, N. P., HAISCH, C., NIESSNER, R. & HORN, H. 2009. Combined use of confocal laser scanning microscopy (CLSM) and Raman microscopy (RM): Investigations on EPS - Matrix. Water Research, 43, 6376. WALTERS, M. C., ROE, F., BUGNICOURT, A., FRANKLIN, M. J. & STEWART, P. S. 2003. Contributions of antibiotic penetration, oxygen limitation, and low metabolic activity to tolerance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to ciprofloxacin and tobramycin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47, 317-323. WANG, I. W., ANDERSON, J. M. & MARCHANT, R. E. 1993. STAPHYLOCOCCUS-EPIDERMIDIS ADHESION TO HYDROPHOBIC BIOMEDICAL POLYMER IS MEDIATED BY PLATELETS. Journal of Infectious Diseases, 167, 329336. WANG, J. 2001. Glucose biosensors: 40 years of advances and challenges. Electroanalysis, 13, 983-988. WATANABE, M., SASAKI, K., NAKASHIMADA, Y., KAKIZONO, T., NOPARATNARAPORN, N. & NISHIO, N. 1998. Growth and flocculation of a marine photosynthetic bacterium Rhodovulum sp. Applied Microbiology and Biotechnology, 50, 682-691. WELLS, T. J., MCNEILLY, T. N., TOTSIKA, M., MAHAJAN, A., GALLY, D. L. & SCHEMBRI, M. A. 2009. The Escherichia coli O157:H7 EhaB autotransporter protein binds to laminin and collagen I and induces a serum IgA response in O157:H7 challenged cattle. Environmental Microbiology, 11, 1803-1814. WILLIAMS, D. L. & BLOEBAUM, R. D. 2010. Observing the Biofilm Matrix of Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 Grown Using the CDC Biofilm Reactor. Microscopy and Microanalysis, 16, 143-152. WILLIAMS, R. J., HENDERSON, B. & NAIR, S. P. 2002. Staphylococcus aureus fibronectin binding proteins A and B possess a second fibronectin binding region that may have biological relevance to bone tissues. Calcified Tissue International, 70, 416-421.

77

WINGENDER, J., STRATHMANN, M., RODE, A., LEIS, A. & FLEMMING, H. C. 2001. Isolation and biochemical characterization of extracellular polymeric substances from Pseudomonas aeruginosa. Microbial Growth in Biofilms, Pt a: Developmental and Molecular Biological Aspects, 336, 302-314. WU, H. & FIVES-TAYLOR, P. M. 1999. Identification of dipeptide repeats and a cell wall sorting signal in the fimbriaeassociated adhesin, Fap1, of Streptococcus parasanguis. Molecular Microbiology, 34, 1070-1081. YANG, L. & BASHIR, R. 2008. Electrical/electrochemical impedance for rapid detection of foodborne pathogenic bacteria. Biotechnology Advances, 26, 135-150. YANG, L. J., LI, Y. B., GRIFFIS, C. L. & JOHNSON, M. G. 2004. Interdigitated microelectrode (IME) impedance sensor for the detection of viable Salmonella typhimurium. Biosensors & Bioelectronics, 19, 1139-1147. YANG, L. J., RUAN, C. M. & LI, Y. B. 2003. Detection of viable Salmonella typhimurium by impedance measurement of electrode capacitance and medium resistance. Biosensors & Bioelectronics, 19, 495-502. YAO, C. Y., ZHU, T. Y., QI, Y. Z., ZHAO, Y. H., XIA, H. & FU, W. L. 2010. Development of a Quartz Crystal Microbalance Biosensor with Aptamers as Bio-recognition Element. Sensors, 10, 5859-5871. YEON, J. H. & PARK, J. K. 2005. Cytotoxicity test based on electrochemical impedance measurement of HepG2 cultured in microfabricated cell chip. Analytical Biochemistry, 341, 308-315. ZHANG, X. Q. & BISHOP, P. L. 2003. Biodegradability of biofilm extracellular polymeric substances. Chemosphere, 50, 63-69. ZHOU, M. X. & WU, H. 2009. Glycosylation and biogenesis of a family of serine-rich bacterial adhesins. MicrobiologySgm, 155, 317-327. ZIKMUND, A., RIPKA, P., KRASNY, L., JUDL, T. & JAHODA, D. 2010. Biofilm Detection by the Impedance Method. 2010 3rd International Conference on Biomedical Engineering and Informatics (Bmei 2010), Vols 1-7, 1432-1434. ZOGAJ, X., NIMTZ, M., ROHDE, M., BOKRANZ, W. & ROMLING, U. 2001. The multicellular morphotypes of Salmonella typhimurium and Escherichia coli produce cellulose as the second component of the extracellular matrix. Molecular Microbiology, 39, 1452-1463.

78

10 Přílohy

Obrázek č. 13: Schéma zapojení použitého impedančního spektroskopu.

Agilent 4594A|Z|=f(f) 9,9980E+03 9,9970E+03 9,9960E+03

|Z|[Ohm]

9,9950E+03 9,9940E+03 9,9930E+03 9,9920E+03 9,9910E+03 9,9900E+03 9,9890E+03 0

10 000 20 000 30 000 40 000 50 000 60 000 70 000 80 000 90 000 100 000 f[Hz]

Graf č. 44: Přesnost použitého impedančního spektroskopu.

79

Relativní směrodatná odchylka 12R

0,045 0,04

Směrodatná odchylka[%]

0,035 0,03

0,025 0,02

0,015 0,01 0,005 0 0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000 100000

f[Hz]

Graf č 45: Opakovatelnost měření použitého impedančního spektroskopu.

80