Studi Pendahuluan : Perkembangan Jaringan Endosperma dan Induksi Pembentukan Kalus dari Endosperma Jeruk Siam (Citrus nobilis L) (Preliminary study: Endosperm development and callus Induction and formation from Endosperm of Tangerine (Citrus nobilis L.)) 1
1
M. Kosmiatin , A. Husni dan A. Purwito
2
1
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No 3A, Bogor. 2 Departemen Agronomi dan Hortikultutra, Fakultas Pertanian, IPB,Jalan Meranti Raya, Dramaga, Bogor E-mail:
[email protected] Abstrak Jeruk merupakan salah satu buah yang konsumsi segarnya cukup tinggi. Hingga saat ini, produksi jeruk di Indonesia menurun antara lain disebabkan oleh alih fungsi areal pertanaman jeruk ke komoditas lain yang lebih menguntungkan. Kurangnya minat penanaman jeruk karena kualitas buah jeruk lokal tidak dapat bersaing dengan jeruk impor sehingga harga tidak dapat bersaing. Kriteria jeruk yang berkualitas adalah jeruk dengan rasa manis-segar, warna menarik, mudah dikupas dan tanpa biji. Jeruk Siam Indonesia sebenarnya sudah memiliki rasa dan warna yang baik tetapi hingga saat ini belum ada jeruk Siam tanpa biji. Salah satu pendekatan pembentukan jeruk tanpa biji adalah dengan mengkulturkan endosperma sehingga dapat beregenerasi membentuk tanaman triploid. Tanaman triploid sulit membentuk biji karena ketidakseimbangan perpasangan kromosom saat gametogenesis. Keberhasilan kultur endosperma ditentukan oleh tahapan perkembangan eksplan endosperma yang memiliki kemampuan untuk berproliferasi dan berdiferensisasi, formulasi media dan lingkungan kulturnya. Penelitian pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui tahapan perkembangan endosperma yang berespon baik untuk dikulturkan, formulasi media untuk proliferasi sel-sel endosperma dan lingkungan kultur yang mendukung pertumbuhannya. Penelitian dilakukan dengan mengkulturkan jaringan endosperma yang diisolasi dari berbagai umur buah muda jeruk pada formulasi media induksi kalus jeruk Siam diploid kemudian dioptimasi dengan menambahkan bahan organik dan biotin. Biakan dikulturkan dalam kondisi gelap, kurang terang dan terang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa endosperma dari buah yang berumur 12 dan 13 minggu setelah anthesis dapat diisolasi dan diinduksi pembentukan kalusnya. Penambahan ekstrak malt atau biotin lebih baik untuk menginduksi pembentukan kalus. Inkubasi pada kondisi kurang cahaya lebih baik dalam menginduksi pembentukan kalus. Kata Kunci: Citrus Nobilis, Kultur Endosperma, Tahapan Perkembangan Kasein Hidrolisat, Ekstrak Malt
Endosperma,
Abstract Citrus is one of the fruits consumed high. Until recently, the production of citrus in Indonesia decreased among others caused by over function of citrus land to other more profitable commodities. Lack of interest in planting of citrus because the quality of the local citrus fruits can't compete with imported oranges so prices cannot compete. Quality of citrus criteria is orange juice with sweet-fresh, attractive colors, easily peeled and seedless. Indonesian tangerine actually already has a good flavor and color but until now there has been no tangerine seedless. One approach to the formation of citrus seedless is culturing of endosperm cells so it can regenerate triploid plant form. Seed formation of triploid plants is difficult because of the unbalance chromosomes pairing during gametogenesis. The success of endosperm culture is determine of development stages of endosperm as explants that have the ability to conduct proliferate and differentiate, medium formulation and culture environment. Preliminary research was conducted to know the stages of endosperm development that response to endosperm cultured, media formulations for the proliferation of endosperm cells and culture environment to supporting its growth. Research done by cultured endosperm cells was isolated from various age of fruit-tangerine on diploid callus induction medium then optimized by adding organic compound and biotin. Endosperm culture cultured at dark, medium light and light incubation room. The results showed that the
527
endosperm cells isolated from young fruit, 12 and 13 weeks after anthesis, can be induced the callus formation. The addition of malt extract or biotin is better to induce the callus formation. Incubation conditions better in medium light induces the formation callus. Keywords: Citrus Nobilis, Endosperm Culture, Stage of Endosperm Development, Kaseinl Hidrolisat, Malt Extract Pendahuluan Jeruk merupakan salah satu komoditas hortikultura nasional yang penting, tetapi hingga saat ini produksi dan daya saingnya terhadap buah jeruk impor masih rendah. Produksi jeruk nasional dibatasi oleh lahan pertanaman yang bersaing dengan komoditas lain yang lebih menguntungkan. Salah satu kendala yang menurunkan daya saing jeruk Siam adalah jumlah biji yang cukup tinggi, sekitar 15 biji/buah, sementara jumlah biji merupakan salah satu kriteria kualitas buah jeruk yang penting dan berdaya saing tinggi (Karp, 2007). Sampai saat ini belum ada jeruk Siam lokal Indonesia yang direkomendasikan buahnya tidak berbiji. Perakitan buah jeruk tanpa biji dapat dilakukan dengan teknik in vitro melalui beberapa pendekatan diantaranya dengan merakit tanaman jeruk yang memiliki tingkat ploidi triploid. Tanaman triploid sangat berharga karena memberikan nilai tambah ekonomi dalam memperbaiki mutu dan kualitas buah karena buahnya tidak berbiji, lebih besar, dan lebih produktif. Selain keunggulan tersebut, tanaman triploid juga mempunyai kemampuan pertumbuhan yang lebih cepat dan bunganya lebih besar (Gupta, 1982) dan lebih cepat panen serta biomassanya lebih besar (Thomas dan Chaturvedi, 2008). Fenomena perubahan tingkat poliploidi ini sangat jarang ditemukan pada tanaman jeruk. Ploidi jeruk pada umumnya adalah diploid dengan jumlah kromosom 18 (Lapin, 1937). Tahiti Lime yang merupakan jenis jeruk komersial tanpa biji yang mempunyai ploidi triploid alami (Bachi, 1940). Tanaman triploid dapat dirakit dengan berbagai cara pendekatan baik secara konvensional maupun non konvensional. Penggunaan endosperma dalam kultur in vitro akan menghasilkan tanaman triploid. Jaringan endosperma berkembang setelah fertilisasi ganda terjadi dan jaringan ini merupakan hasil fusi antara 2 inti polar dan satu inti generatif sperma sehingga sel yang berkembang merupakan sel yang triploid (Berger, 2003). Jaringan ini dapat dikulturkan pada saat sel-selnya sudah berkembang dengan dinding sel yang tumbuh sempurna. Menurut Hoshino et al., (2011), tanaman triploid yang dihasilkan dari kultur endosperm lebih unggul dari pada tanaman triploid dari hasil persilangan. Keberhasilan kultur endosperma ditentukan oleh berbagai faktor, diantaranya adalah tahapan endosperma, formulasi media dan kondisi pengkulturan. Endosperma muda mempunyai fase sel-sel yang baru dan pada umumnya mempunyai respon yang lebih baik apabila dikulturkan (Tao et al., 2009) seperti pada tanaman jeruk besar dan apel (Wang dan Chang, 1978), Citrus grandis cv White Siamese (Gmitter et al., 1990), cv Tosa-Buntan (Yang et al., 2000), Citrus sinensis cv Hongjiang (Chen et al., 1990), dan cv Ridge Pineaple (Gmitter et al., 1990).
528
Penelitian bertujuan untuk mengetahui tahapan perkembangan endosperma yang respon untuk kultur in vitro dan mengetahui formulasi media untuk menginduksi pembentukan kalus dari endosperma. Metodologi Penelitian dilakukan di laboratorium kultur in vitro Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor. Bahan tanaman yang digunakan adalah tanaman jeruk Siam yang berumur 5 tahun setelah disambung dari mata tunas sebagai sumber jaringan endosperma. Penelitian dilakukan dalam dua kegiatan berurutan yaitu studi tahapan perkembangan endosperma jeruk Siam dan induksi pembentukan kalus dari jaringan endosperma. Studi tahapan perkembangan endosperma jeruk Siam Bahan tanaman yang digunakan adalah buah muda yang berumur 8, 9, 10, 11, 12, 13, dan 14 minggu setelah anthesis. Buah diukur diameternya
sebelum disterilisasi.
Sterilisasi buah dilakukan dengan merendam buah dalam alkohol 96% kemudian dilalukan pada lampu bunsen. Biji diisolasi kemudian dipotong secara transversal untuk mengamati perkembangan embrio dan endosperma. Pengamatan dilakukan dengan bantuan mikroskop binokuler pada perbesaran 40 kali. Pengamatan dilakukan pada visual ukuran biji, visual endosperma dan embrio. Induksi pembentukan kalus dari jaringan endosperma Tahapan perkembangan endosperma Bahan tanaman yang dikulturkan adalah jaringan endosperma dari berbagai umur buah jeruk, 10, 11,12, 13, 14 minggu setelah anthesis. Sterilisasi buah dilakukan dengan merendam buah dalam alkohol 96% kemudian dilalukan pada lampu bunsen. Isolasi endosperma dilakukan dalam laminar air flow cabinet dengan bantuan mikroskop binokuler dengan perbesaran 40x. Endosperma diisolasi dari biji yang dikeluarkan dari buah yang sudah disterilkan. Endosperma dikulturkan pada formulasi media induksi pembentukan kalus embriogenik jeruk Siam diploid (Husni, 2010). Biakan kemudian diinkubasi di ruang kultur tanpa cahaya. Lingkungan Kultur Bahan tanaman yang digunakan adalah jaringan endosperma yang diisolasi dari buah berumur 13 minggu setelah anthesis. Jaringan endosperma dikulturkan pada media induksi pembentukan kalus embriogenik jeruk Siam diploid (Husni, 2010). Biakan dikulturkan pada lingkungan gelap (tanpa cahaya) dan cahaya rendah ( ±600 lux) selama 16 jam. o
Temperatur ruang kultur dijaga pada suhu 22-25 C. Optimasi media induksi pembentukan kalus dari jaringan endosperma Optimasi induksi pembentukan kalus dilakukan pada media Husni et al. (2010) dengan penambahan biotin 0.7 mg/l; ekstrak malt 500 mg/l; kaseinl hidrolisat 250 mg/l; ekstrak malt +biotin; kaseinl hidrolisat + biotin. Bahan tanaman yang digunakan adalah
529
jaringan endosperma yang diisolasi dari buah muda berumur 13 minggu setelah anthesis. Biakan diinkubasi di ruang kultur dengan cahaya rendah (± 600 lux) selama 16 jam dan suhu o
ruang kultur dijaga pada suhu 22-25 C. Pengamatan pada induksi kalus dari jaringan endosperma dilakukan setiap minggu. Pengamtan dilakukan terhadap persentase pembentukan kalus dan embriosomatik langsung. Hasil dan Pembahasan Studi tahapan perkembangan endosperma jeruk Siam Hasil pengamatan menunjukkan bahwa buah yang berumur 8 dan 9 minggu setelah anthesis dengan mikroskop binokuler pembesaran 40x belum dapat mengamati embrio dan jaringan endosperma (Tabel 1). Endosperma masih berupa cairan yang diduga merupakan sel induk endosperma dengan multi inti bebas yang belum mengalami selulerisasi. Pada tahapan ini baik embrio zigotik maupun nuselar belum teramati. Tabel 1. Tahapan perkembangan endosperma pada buah 8-14 minggu setelah anthesis. Umur Buah (MSA)
Ukuran yang teramati Buah (cm)
Biji (cm)
8 9 10 11 12 13 14
1,3 1,7 2,0 2,1 2,4 3,0 3,5
0,2 0,3 0,4 0,55 0,6 0,7 0,9
Keterangan : MSA , minggu setelah anthesis * Embrio nuselar 1-2 buah/biji - Endosperma inti bebas (cair)
Embrio (m) < 100 100-150 100-200 >200* >500**
Endosperma (volume) + ++ ++ + Tidak ada
** Embrio nuselar >2 buah/biji + Endosperma kental
Embrio dan endoperma mulai teramati pada minggu ke sepuluh setelah anthesis. Embrio zigotik tumbuh di bagian mikrofil kantung embrio (biji) dengan ukuran kurang dari 100 (m) dan endosperma mulai terlihat mengental membentuk jaringan seperti jelly, meskipun masih banyak bagian yang cair. Jaringan endosperma yang mengental bertambah hingga umur 12 minggu setelah anthesis. Volume endosperma mulai berkurang pada minggu ke 13 seiring dengan tumbuhnya embrio nuselar pada dinding mikrofil kantung embrio. Pada minggu ke 14 jaringan endoperma tidak terlihat lagi, pada beberapa biji terlihat jaringan tipis transparan (tembus pandang) yang merupakan sisa dari jaringan endosperma. Pada tahapan ini embrio zigotik sudah mencapai masak morfologis (bentuk torpedo) dan embrio nuselar sudah bertambahan banyak (lebih dari 3) dengan berbagai tahapan perkembangan embrio. Induksi pembentukan kalus dari jaringan endosperma Tahapan perkembangan endosperma Berdasarkan pengamatan pada buah, jaringan endoperma mulai teramati pada buah yang berumur 10 - 14 minggu setelah anthesis. Jaringan endosperma tersebut diisolasi
530
kemudian dikulturkan pada media induksi pembentukan kalus jeruk Siam diploid (Husni et al, 2010). Setelah 6 minggu dikulturkan, terlihat bahwa hanya endosperma yang berasal dari buah 12 dan 13 minggu setelah anthesis yang dapat diinduksi pembentukan kalusnya dengan persentase yang tidak terlalu tinggi hanya 7,14 dan 3,10% (Tabel 2). Gmitter et al., (1990) melaporkan bahwa kalus terinduksi dari endosperma jeruk manis (C. sinensis), grape fruit (C. paradisiaca) dan Pommelo (C. grandis, sekarang C. maxima) dari endosperma 1214 minggu setelah anthesis. Persentase yang rendah pada penelitian ini mungkin disebabkan formulasi media dan lingkungan kultur belum mampu menginduksi pembentukan kalus secara maksimal. Hal ini menunjukkan bahwa walaupun komposisi media untuk induksi pembentukan kalus dengan eksplan embrio zigotik dan nuselar (dengan tingkatan ploidi diploid) cukup baik, ternyata tidak cukup baik untuk menginduksi pembentukan kalus dari jaringan endosperma (triploid). Tabel 2. Respon jaringan endosperma pada berbagai tahapan perkembangan pada media induksi kalus, 6 minggu setelah dikulturkan pada media induksi kalus (Husni et al., 2010) Umur endosperma (Minggu Setelah Anthesis) 10 11 12 13 14
Kalus 0 0 7,14 3,10 0
Respon biakan (%) Embriosomatik langsung 0 0 0 0 0
Lingkungan Kultur Lingkungan kultur terutama cahaya sangat mempengaruhi respon dari eksplan. Beberapa eksplan memerlukan kondisi cahaya terang (± 1000 lux) selama 16 jam, atau cukup dengan cahaya rendah atau bahkan kodisi gelap untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangannya. Induksi pembentukan kalus sering tidak memerlukan cahaya seperti pada tanaman Allium chinense (Yan et al., 2009).
Pada beberapa tanaman, cahaya
diperlukan untuk menginduksi eksplan dalam pembentukan kalusnnya seperti pada jeruk Siam dengan eksplan embrio nuselar dan embrio zigotik (Husni et al., 2010), tanaman obat Cardiospermum halicacabum (Thomas dan Mseena, 2006), Curcuma soloensis (Zhang et al., 2011). Jaringan endosperma diisolasi dari buah yang berumur 13 minggu setelah anthesis. Enam minggu setelah inkubasi terlihat bahwa induksi kalus dari jaringan endosperma lebih respon pada kondisi cahaya rendah, sekitar 600 lux selama 16 jam (Tabel 3). Pada kultur endosperma ini juga terbentuk embriosomatik langsung meskipun persentasenya juga rendah. Pada induksi kalus jeruk Siam dengan menggunakan eksplan embrio zigotik dan nuselar (diploid) lebih baik dilakukan pada kondisi terang (Husni et al., 2010). Hal yang berbeda pada eksplan jaringan endosperma (triploid) jeruk Siam Medan dimana kondisi kultur dengan cahaya 100 lux, induksi pembentukan kalusnya kurang dari 10% (Tabel 2). Pada kondisi gelap, induksi kalus dari jaringan endosperma juga tidak berhasil dengan baik.
531
Hasil yang lebih baik diperoleh dari eksplan yang dikulturkan pada kondisi cahaya rendah, sekitar 600 lux, meskipun masih kurang dari 50%. Tabel 3. Persentase pembentukan kalus dan embrio somatik langsung pada inkubasi kultur gelap dan cahaya rendah, 6 minggu setelah dikulturkan pada media induksi kalus (Husni et al., 2010). Lingkungan inkubasi Kalus 2,38 23,81
Gelap Cahaya rendah
Respon biakan (%) Embriosomatik langsung 4,76 7,14
Optimasi media induksi pembentukan kalus dari jaringan endosperma Menurut Yan et al. (2009), untuk keberhasilan induksi kalus pada tanaman A. sinensis selain ditentukan oleh eksplan yang tepat juga sangat ditentukan oleh formulasi media yang tepat. Pada jeruk, umumnya induksi kalus dilakukan dengan menambahkan BA pada media induksi kalusnya (Gmitter et al., 1990; Carimi et al., 1995; Khan et al., 2009). Induksi kalus dari embrio nuselar dan zigotik jeruk Siam berhasil dilakukan dengan baik pada media MS modifikasi dengan penambahan BA 3 mg/l (Husni et al., 2010), tetapi untuk eksplan endosperma hasil belum begitu baik sehingga diupayakan dengan penambahan bahan organik untuk mengoptimalkan pembentukan kalus dari eksplan endosperma. Optimalisasi pembentukan embrio dicoba dengan menambahkan bahan organik (kasein hidrolisat dan ekstrak malt) kedalam media dan memperkaya vitamin dengan menambahkan biotin kedalam media induksi. Hal ini juga dilakukan Gmitter et al. (1990) dan Yang et al. (2000)
yang lebih memperkaya medium induksi kalus untuk endosperma
dibanding medium untuk jaringan diploidnya. Pada kultur endosperma jeruk Siam, enam minggu setelah kultur terlihat bahwa induksi pembentukkan kalus terbaik diperoleh dari media dengan penambahan biotin atau ekstrak malt (Tabel 4). Sementara penambahan kasein hidrolisat tidak dapat meningkatkan persentase pembentukan kalus dari jaringan endosperma jeruk meskipun bahan ini banyak digunakan untuk kultur endosperma tanaman dikotil (Hoscino et al., 2011). Kombinasi bahan organik dengan vitamin juga tidak meningkatkan pembentukan kalus dari jaringan endiosperma, berbeda dengan tanaman jambu biji (Rai et al., 2008) penambahan bahan organik yang dikombinasikan dengan vitamin dapat meningkatkan induksi kalus embriogenik. Induksi kalus dari eksplan jeruk Siam medan lebih efektif pada media dengan penambahan ekstrak malt karena bahan ini merupakan bahan organik yang lebih murah dari pada biotin. Tabel 4. Respon jaringan endosperma pada berbagai formulasi media untuk induksi pembentukan kalus, pada media induksi kalus (Husni et al., 2010). Media induksi (Minggu Setelah Anthesis) Biotin Ekstrak malt Kasein hidrolisat Ekstrak malt +Biotin Kaseinl hidrolisat+ Biotin
532
Kalus 53.13 53.13 36.47 40.64 48.98
Respon biakan (%) Embriosomatik langsung 0 0 20,83 0 0
Kesimpulan Dari rangkaian penelitian pendahuluan ini dapat disimpulkan bahwa : -
Jaringan endosperma jeruk dapat diisolasi dari buah muda 10-14 minggu setelah anthesis
-
Jaringan endosperma yang respon untuk diinduksi pembentukan kalusnya adalah endosperma yang diisolasi dari buah 12-13 minggu setelah anthesis
-
Inkubasi pada lingkungan cahaya rendah (± 600 lux) lebih baik dibandingkan pada kondisi gelap
-
Penambahan ekstrak malt atau biotin baik untuk menginduksi pembentukan kalus, tetapi secara ekonomis penambahan ekstrak malt lebih menguntungkan. -
-
Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini didanai oleh program Hibah Pasca Sarjana atas nama Dr. Agus Purwito (FAPERTA, IPB) Tahun Anggaran 2011 dan Balitjestro yang sudah menyedikan bahan tanaman jeruk Siam Medan.
-
Daftar Pustaka
-
Bachi, O. 1943. Cytological observations in citrus, III Megasporogenesis, fertilization and polyembryony. Bot. Gaz. 105: 221-225
-
Carimi, F, F De Pasquale, F G Crescimanno. 1995. Somatic embryogenesis in Citrus from styles culture . Plant Science 105: 81-86
-
Chen, Z G, S Q Lin and Q L Lin. 1988. The development of plantlets from the endosperm of loquat. Pp 363-364. In Genetic Manipulation in Crops. Proc. Int. Symp. Genetic Manipulation in Crops, Beijing.
-
Hoshino,T, Y Miyashita, And TD Thomas. 2011. In vitro culture of endosperm and its application in plant breeding: Approaches to polyploidy breeding. Scientia Horticulture. 130 (1):1-8
-
Husni A, Purwito A, Mariska I, Sudarsono. 2010. Regenerasi tanaman jeruk Siam melalui embryogenesis somatic. J Agrobiogen 6(2): 79-83
-
Lapin, W.K. 1937. Investigation of polyploidy in citrus work. All-Unian Sci. Res. Inst. Humid Subtrop.I:1-68
-
Gmitter, F G Jr., X B Ling, and X X Deng. 1990. Induction of triploid Citrus plants from endosperm calli in vitro. Theor. Appl. Gen. 80: 785-790
-
Khan, E U, X Z Fu, J Wang, Q J Fan, X S Huang, G N Zhang, J Shi, J H Liu. 2009. Regeneration and characterization of plants derived from leaf in vitro culture of two sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck) cultivars. Sci Hortic. 120: 70-76
-
Karp, D. 2007. Mandarins growing nears Bakersfield, Calif. Marisorpa, Calif
-
Thomas, T D, and R Chaturverdi. 2008. Endosperm cultura: A novel method for triploid plant. Plant Cell. Tiss. Org. Cult. 93 (1):1-14
-
Tao, R, K Ozawa, M Tamura and A Sugiura. 2009. Dodecaploid plant regeneration from endosperm cultura of Persimmon (Diospyros kaki L.).
-
Wang D, and C J Chang. 1978. Triploid citrus plantlet from endosperm culture. Scie Sinica. 21: 822-827
533
-
Yang, X, A Kitajima and K Hasegawa. 2000. Callus induction and embryoid regeneration from the endosperm culture of “Tossa-Buntan” pummel (Citrus grandis [L.]). Environment Control Biol. 38 (4): 241-246
-
Yan, MM, C Xu, C-H Kim, Y-C Um, A Bah, D-P Guo. 2009. Effects of explant type, culture media and growth regulators on callus induction and plant regeneration of Chinese jiaotou (Allium chinense). Sci Hortic. 123:124-128
-
Zhang, S, N Liu, A Sheng, G Ma, G Wu. 2011. Direct and callus-mediated regeneration of Curcuma soloensis Valeton (Zingiberaceae) and ex vitro performance of regenerated plants. Sci Hortic. 130: 899-
Diskusi 1.
534
Nama Penanya Pertanyaan/saran/komentar Jawab
: : :
