Journal Of Marine Research. Volume 1, Nomor 2, Tahun 2012, Halaman 197-202 Online di: http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jmr Karakterisasi Metabolit Sekunder Bakteri Simbion Gastropoda Conus miles dengan Metode GC-MS Sebagai Antibakteri MDR (Multi Drug Resistant) Nurul Fitrah Hasanah, Delianis Pringgenies, Sri Yulina Wulandari Program Studi Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Kampus Tembalang, Semarang 50275 Telp/Fax. 024-7474698
ABSTRAK Telah diketahui bahwa bakteri simbion yang bersimbiosis dengan gastropoda Conus miles memiliki potensi yang mampu menghasilkan senyawa antibakteri terhadap bakteri MDR (Multi Drug Resistant). Informasi yang ditemukan sebelumnya dari isolasi bakteri simbion dan berdasarkan hasil skrining, besar kecilnya zona hambat dan sifat penghambatannya terhadap beberapa jenis bakteri uji memperlihatkan bahwa isolat yang berasal dari simbion Gastropoda Conus miles memiliki karakteristik dengan tingkat kekerabatan sebesar 98% pada bakteri Pseudoalteromonas sp. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui karakteristik senyawa bioaktif bakteri simbion yang berasosiasi dengan Moluska jenis Conus miles. Penelitian dilakukan tiga tahap yakni isolasi dan pemurnian bakteri; identifikasi karakterisasi isolat melalui hasil reaksi pada uji fisiologis dan uji biokimia; serta identifikasi senyawa metabolit sekunder dengan metode GC-MS QP2010S SHIMADZU. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa isolat bakteri simbion memiliki sejumlah senyawa dengan persentase puncak senyawa tertinggi hingga terendah yakni senyawa, Acetic acid (CAS) Ethylic acid (35.22%); Propanoic acid, 2methyl-(CAS) Isobutyric acid (11.78%); Iso-valeric acid (9.38%); Butanoic acid, 2-methyl(CAS) 2-methylbutanoic acid (4.74%); dan 1,2-Benzenedicarboxylic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl phthala (4.36%). Hasil penelitian disimpulkan bahwa isolat bakteri simbion yang diperoleh dalam penelitian ini memberikan informasi hasil yang berpotensi sebagai antibiotik baru. Kata kunci : Bakteri simbion, anti-bakteri, senyawa bioaktif.
ABSTRACT It is known that the bacterial symbionts are symbiotic with gastropods Conus miles has the potential to be able to produce antibacterial compounds against bacterial MDR (Multi Drug Resistant). Information found previously from bacterial symbionts and isolation based on screening results, the size of the zone of inhibition and inhibitory properties against several types of bacteria tests showed that isolates derived from Conus miles Gastropoda symbionts characterized by kinship rate of 98% in bacteria Pseudoalteromonas sp. The research objective was to determine the characteristics of the bacterial symbiont bioactive compounds associated with the type of mollusk Conus miles. The study was conducted three phases namely the isolation and purification of bacteria; characterization of isolates identified through test results on the reaction of physiological and biochemical tests, as well as the identification of secondary metabolites by GC-MS method QP2010S Shimadzu. The results showed that the bacterial symbiont isolates had a number of compounds with a percentage of the highest peak to the lowest compound the compound, Acetic acid (CAS) ethylic acid (35.22%); propanoic acid, 2methyl-(CAS) Isobutyric acid (11.78%); Iso -valeric acid (9:38%), butanoic acid, 2-methyl(CAS) 2-methylbutanoic acid (4.74%) and 1,2-Benzenedicarboxylic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl phthala (4:36%). The results concluded that the bacterial symbiont isolates obtained in this study provide information on the results of potentially new antibiotics. Keywords: Bacterial symbionts, anti-bacterial, bioactive compounds.
Journal Of Marine Research. Volume 1, Nomor 2, Tahun 2012, Halaman 198
Pendahuluan Biota laut (marine organism) merupakan sumber bahan alam yang sangat kaya dengan aktivitas biologi yang unik. Beberapa diantaranya mempunyai aktivitas antifungi dan antitumor. Disamping itu ada juga yang mempunyai aktivitas sebagai stimulan kekebalan dan penghambat ensim tertentu. Selama 30 tahun terakhir, lebih dari 7000 senyawa aktif berhasil diisolasi dari biota laut dan digunakan sebagai rujukan dalam pengembangan obat baru (Edrada, 1998). Seperti dinyatakan oleh Watermann, 1999; Burgess et al. (2003) bahwa mikroorganisme yang berasosiasi dengan organisme laut akan mensintesa metabolit sekunder seperti yang dihasilkan oleh organisme inangnya. Senyawa halichondrin B misalnya, merupakan salah satu contoh senyawa alam dari laut dengan struktur sangat komplek yang hanya dapat diisolasi dari organisme penghasilnya. Organisme yang dapat dikulturkan dalam jumlah besar, merupakan kondisi yang ideal untuk dilakukan eksplorasi kandungan senyawa kimia, beberapa di antaranya adalah mikroorganisme laut. Keberadaan bakteri yang berasosiasi dengan moluska laut telah memungkinkan penggunaan jenis bakteri tersebut sebagai sumber utama bakteri yang baru. Buktibukti ilmiah menunjukkan bakteri-bakteri yang berasosiasi dengan gastropoda jenis Conus miles mempunyai peranan dalam produksi senyawa bioaktif sehingga menjadi landasan dalam pencarian senyawa antimikroba dari bakteri yang berasosiasi dengan Moluska (Pringgenies et al., 2008). Kandungan senyawa metabolit sekunder yang termasuk ke dalam golongan metabolit telah terbukti bekerja sebagai derivat antibakteri. Penelitian ini difokuskan untuk mencari senyawa bioaktif yang terdapat pada mikroorganisme laut terutama bakteri simbion yakni bakteri yang berasosiasi dengan biota lain. Conus miles, salah satu spesies dari jenis gastropoda menjadi suatu objek penelitian yang menarik, yakni adanya racun yang memiliki efek mematikan terhadap biota
lain termasuk manusia (Islami, 2008). Berdasarkan fakta inilah perlu dilakukan penelitian lain mengenai potensi senyawa bioaktif terutama bakteri simbion yang terdapat didalam Conus untuk manfaat lain khususnya sebagai antibakteri MDR. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui karakteristik senyawa bioaktif bakteri yang berasosiasi dengan gastropoda jenis Conus miles dengan menggunakan metode GCMS. Materi dan Metode Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan, yaitu pada bulan Juli 2009 – Januari 2010, yang meliputi Isolasi dan pemurnian bakteri yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Institut Obat Bahan Alam, Universitas Diponegoro. Uji biokimia dan karakterisasi bakteri; dan Identifikasi senyawa metabolit sekunder dengan menggunakan analisa GC-MS yang dilakukan di Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI(Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia) Bogor. Materi penelitian yang digunakan, yaitu Isolat bakteri yang berasosiasi dengan gastropoda jenis Conus miles, yang diperoleh dari Perairan pulau Bastiong Kepulauan Ternate, Maluku. Hasil seleksi dari isolat bakteri simbion ini yang sudah dilakukan sebelumnya memperlihatkan bahwa terdapat adanya isolat yang dianggap paling berpotensi untuk dijadikan sebagai sumber antibiotik baru berdasarkan konsistensi hasil skrining, besar kecilnya zona hambat yang dihasilkan dan sifat penghambatannya pada uji terhadap beberapa jenis bakteri patogen klinik (MDR) jenis Klebsiella, E.coli, Coagulase Negatif Staphylococcus (CNS), Enterobacter 5, Enterobacter 10 dan Pseudomonas. Amplifikasi DNA dari isolat bakteri simbion yang sudah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa isolat menghasilkan single band (pita tunggal) dengan ukuran sekitar 1500 bp sesuai dengan pembandingan menggunakan marker DNA. Hasil analisis homologi menggunakan BLAST searching menunjukkan bahwa isolat TCM 6.1 memiliki prosentase kesamaan
Journal Of Marine Research. Volume 1, Nomor 2, Tahun 2012, Halaman 199
tertinggi dengan genus Pseudoalteromonas sp. (99%). Hasil penelitian ini dilanjutkan untuk mengetahui karakterisasi isolat bakteri simbion dengan menggunakan uji biokimia dan analisis senyawa yang terdapat dalam isolat dengan analisis Gas Chromatography – Mass Spectrometer (GCMS). Uji biokimia Pada uji ini dilakukan beberapa tahap pengujian yakni uji Motilitas untuk mengetahui kemampuan pergerakan bakteri; uji Indole dengan cara mengamati perubahan warna yang terjadi setelah penambahan reagen Kovacs kedalam media Tryptone Soya Broth (TSB) yang telah diinokulasikan isolat bakteri selama 1-2 hari; uji Oksidase dengan cara mengamati perubahan warna pada kertas filter yang telah dibasahi oleh reagen oksidase disekitar area yang diolesi dengan biakan bakteri. Uji VP (Voges-Proskauer) untuk menguji adanya 2,3 butadianol yang dihasilkan oleh bakteri dengan cara penambahan reagen 5% α-naphthol didalam ethyl alcohol absolut dan 40% KOH-Creatine. Uji Nitrat untuk menentukan kemampuan bakteri dalam mereduksi nitrat menjadi nitrit, dengan cara penambahan reagen 0,8% sulfanilic acid; 0,6% αnaphthylamine; dan serbuk zink kedalam medium Nitrate broth yang telah ditanami isolat. Uji Urease untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisa urea menjadi amoniak karena adanya bakteri yang dapat mensintesa enzim urease dengan cara menginokulasikan isolat bakteri pada media urea dengan suhu 35°C selama 24 jam. Uji ONPG (orthoNitrophenyl-β-galactoside adalah uji untuk menunjukkan adanya enzim β-galactoside untuk membedakan fermentasi laktosa dari non-fermentasi laktosa oerganisme dengan menggunakan kultur dari media TSI (Triple Sugar Iron) yang mengandung lactose pada suhu 36°C selama 20 menit sampai dengan 1 jam yang ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada media tabung apabila
reaksi positif. Uji Simon citrat dilakukan dengan cara biakan bakteri diinokulasikan kedalam medium Simmon’s Citrate Agar dengan cara goresan menggunakan jarum ose steril selama 1-4 hari, untuk menguji kemampuan bakteri dalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon utama bagi bakteri. Uji Casein untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghancurkan chitin (mencerna) karena mempunyai enzim chitinase dengan cara media yang sudah dicampur dengan chitin ditanami dengan bakteri dan diinkubasi selama 2-4 hari yang ditandai dengan terbentuknya daerah yang jernih disekitar pertumbuhan bakteri. Analisis Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS) Analisis GC-MS dilakukan menggunakan GC-MS QP2010S Shimadzu dengan kondisi analisis sebagai berikut: kolom berjenis Rtx-5MS 30mm dan diameter internal 0,22mm. Gas pembawa yang digunakan Helium dengan tingkat temperatur injektor 320°C, tekanan 13,7 kPa, aliran total 40mL/menit, aliran kolom 0,50mL/menit, kecepatan linier 25,90 cm/detik, purge flow 3 mL/menit, split ratio 73,0 dan temperatur kolom terprogram dari 70°C (dipertahankan selama 5 menit) hingga 300°C (dipertahankan selama 52 menit) dengan laju kenaikan temperatur sebesar 10°C /menit, temperatur sumber ion 250°C dan interface temperature 320°C. Jumlah senyawa yang terdapat dalam ekstrak ditunjukkan oleh puncak (peak) pada kromatogram sedangkan nama/jenis senyawa yang ada diinterpretasikan berdasar data spektrum dari tiap puncak dengan menggunakan metode pendekatan pustaka pada database GC-MS (Hendayana, 1994 dalam Pringgenies, 2010).
Journal Of Marine Research. Volume 1, Nomor 2, Tahun 2012, Halaman 200
Hasil dan Pembahasan Uji skrining terhadap isolat bakteri simbion gastropoda Conus miles dari perairan pulau Bastiong Kepulauan Ternate, Maluku telah dilakukan. Hasil ini dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri aktif yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang sangat menjanjikan karena isolat mampu menghambat bakteri MDR lebih dari satu jenis yang meliputi Klebsiella, Pseudomonas, Staphylococcus, E.coli, dan Enterobacter (Pringgenies, 2010). Dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa isolat TCM 6.1 memiliki kekerabatan terdekat dengan Pseudoalteromonas sp. Anggota dari Alteromonadales telah dikenal sebagai produser dominan antibiotik (Long and
Azam, 2001; Grossat et al., 2004). Lebih lanjut Radjasa et al (2007) melaporkan aktivitas antibakteridari bakteri Pseudoalteromonas luteoviolacea TAB 4.2 yang berasosiasi dengan karang keras Acropora sp. aktif menghambat pertumbuhan bakteri karang dan patogen. Bakteri genus Pseudoalteromonas diketahui memiliki fragmen gen non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) yang diketahui mampu menghasilkan siderophore Alterobactin (Deng et al., 1995 dalam Pringgenies, 2010). Hasil uji biokimia bakteri simbion gastropoda Conus miles (Tabel 1) :
Tabel 1. Hasil Uji Biokimia Isolat Bakteri TCM 6.1 Perlakuan / Uji Pewarnaan Gram Bentuk Koloni Spora Bentuk Spora Panjang cell Motilitas Aerobik An aerobik Uji Katalase Uji Oksidase Uji Glukosa Hugh Leifson (O/F) 10% NaCl Reduksi Nitrat Uji Indole Uji ONPG VP 50° C Citrate Glukosa Acid Hidrolisis : Starch Urea Casein
Isolat Bakteri TCM 6.1 + Besar Panjang + Sub Terminal/Central < 3μm + + + + + + + + +
Journal Of Marine Research. Volume 1, Nomor 2, Tahun 2012, Halaman 201
Pada hasil uji biokimia, diketahui salah satu karakteristik dari isolat bakteri adalah tidak terdapatnya aktivitas produksi enzim triptofanase dari bakteri. Hal ini terlihat pada hasil uji Indole yang bersifat negatif ditandai dengan tidak terbentuknya lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Karakteristik lain yang terdapat pada isolat adalah bahwa bakteri jenis ini
memiliki enzim katalase yang berperan dalam aktivitas bakteri menguraikan H2O2 (Hidrogen peroxide) yang bersifat racun, terlihat dalam pengujian biokimia uji katalase. Analisis GC-MS dilakukan pada isolat aktif TCM 6.1 sebagai fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri terbaik. Pendugaan senyawa dilakukan dengan menggunakan Gas Chromatography menunjukkan terdapat beberapa puncak senyawa dengan tingkat prosentase dan waktu tambat seperti tertera pada Gambar 1 dan Tabel 2.
Gambar 1. Kromatogram GC-MS Hasil Isolat bakteri TCM 6.1
Tabel 2. Waktu Tambat dan Konsentrasi Metabolit Sekunder Hasil Analisa GC-MS
Puncak
Area
1 2 3 4
Waktu Retensi 3.882 4.005 7.194 10.396
1397641 156652 2080870 696112
Kons. (%) 23.66 2.65 35.22 11.78
5 6
12.630 12.893
554295 280034
9.38 4.74
7 8
29.897 39.813
163630 257827
2.77 4.36
9 10
41.738 47.888
120556 200680
2.04 3.40
Nama Senyawa Nitrogen oxide (N2O) (CAS) Nitrous oxide 1,3-Dioxolane, 2-(6-octynyl)-(CAS) Acetic acid (CAS) Ethylic acid Propanoic acid, 2-methyl-(CAS) Isobutyric acid Iso-VALERIC ACID Butanoic acid, 2-methyl-(CAS) 2methylbutanoic acid 1-Pentadecanol (CAS) Pentadecanol 1,2-Benzenedicarboxylic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl phthala Tetradecane, 1-iodoCholestane, 3-thiocyanato-, (3.alpha.,5.alpha.)-(CAS) Thiocyanic acid,.5.alp
Journal Of Marine Research. Volume 1, Nomor 2, Tahun 2012, Halaman 202
Hasil GC-MS pada sampel fraksi TCM memperlihatkan bahwa pada fraksi terdeteksi 10 puncak utama, tetapi hanya 3 senyawa utama tertinggi yang lebih dominan yakni Acetic acid (CAS) Ethylic acid, Propanoic acid, 2-methyl-(CAS) Isobutyric acid dan Iso Valeric acid. Senyawa acid memperlihatkan senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri dengan cara menghancurkan dinding sel dan menghambat sintesis dinding sel (Mutchler, 1991). Diduga senyawa acid tersebutlah yang berperan memiliki kemampuan antibakteri (Kim et al., 2004). Acetic acid, diproduksi dan diekskresikan oleh bakteri asam asetat, yang terkenal pada genus acetobacter, Clostridium acetobutylicum. Acetic acid berperan sebagai agen antibakteri ringan seperti yang dinyatakan oleh Hillenga et al., (1995), Asam Benzenasetat digunakan dalam pembuatan Penicilin G. dan Asam Benzen-asetat mempunyai kemampuan untuk menembus membran plasma pada sel. Kesimpulan Isolat bakteri yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang sangat berpotensial karena isolat mampu menghambat bakteri MDR. Hasil GC-MS pada sampel fraksi terdapat 10 puncak senyawa dengan 3 senyawa yang lebih dominan yakni Acetic acid (CAS) Ethylic acid, Proanoic acid, 2-methyl-(CAS) Isobutyric acid, dan Iso Valeric acid. Isolat TCM bakteri simbion gastropoda Conus miles memberikan kontribusi sebagai sumber alternatif baru metabolit sekunder dari bahan farmasi laut dalam menghasilkan produk sebagai desinfektan. Ucapan Terimakasih Penelitian ini dibiayai oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan Nasional, Hibah Kompetensi 2010. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Ir. Delianis Pringgenies, M.Sc Jur. Ilmu Kelautan FPIK UNDIP Semarang. Kepada reviewer Jurnal Penelitian Kelautan disampaikan penghargaan atas review yang sangat berharga pada artikel ini.
Daftar Pustaka Burgess J.G., K.G. Boyd, E. Amstrong, Z. Jiang, L. Yan, M. Berggren, U. May, T. Pisacane, A. Granmo, and D.R. Adams, 2003. Development of a marine natural product-based antifouling paint. Biofouling, 19:197- 205 Hendayana, S. 1994. Kimia Analitik Instrumen, Edisi kesatu, IKIP Press, Semarang, hal. 219 dan 243. Kim TK, MJ Garson, and J A Fuerst. 2005. Marine actinomycetes related to the Salinospora group from the Great Barrier Reef sponge Pseudoceratina clavata. Environ. Microbiol., 7:509-518 Long R, and F. Azam, 2001. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria. Appl Environ Microb., 67:4975-4983 Proksch, P., R.A. Edrada, and R. Ebel. 2002. Drugs from the sea-current status and microbiological implications. Appl. Microbiol. Bio-technol., 59:125-134. Pringgenies, D, O.K. Radjasa, dan A. Sabdono. 2008. Bioprospeksi Moluska dan Bakteri Simbionnya Dalam Rangka Penanganan Strain MDR (Multi Drug Resistant. Program Intensif Riset Dasar 200/2008. Lembaga Penelitian Univeristas Diponegoro. November 2008. Laporan Penelitian. 40 Hal. Pringgenies, D. Karakterisasi Senyawa Bioaktif Bakteri Simbion Moluska dengan GC-MS. Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis, Vol.2, No.2, Hal.34-40, Desember 2010 Sukarmi dan O.K. Radjasa. 2007. Biotechnical Consideration in the Search for Bioactive Compounds from Reef’s Invertebrates. J. Appl. Sci., 7(8): 1235-1238 Watermann, B. 1999. Alternative antifoulant techniques present and future. Limno. Mar., 1(6):6-7
