Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian Isolasi bakteri kitinolitik dari Sumber Air Panas Penen Pengukuran Indeks kitinolitik Penentuan Isolat Terpilih
Penentuan Waktu Produksi Enzim Kitinase Sampai hari ke-8
Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase dan Perhitungan Kadar Protein pada Produksi Enzim Kitinase Hari ke-4
Presipitasi Enzim Kitinase pada Beberapa Konsentrasi Amonium Sulfat
Presipitasi Enzim Kitinase pada Konsentrasi 50% Amonium Sulfat (Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase dan Perhitungan Kadar Protein)
Dialisis
Penentuan suhu dan pH optimum
Penentuan nilai Km dan Vmaks
Identifikasi Isolat Terpilih berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA
Lampiran 2. Kurva Standard N-Acetyl-D-Glukosamin (GlcNAc) GLcNAc (µgram) 0 10 20 30 40
Absorbansi 0,6615 0,5685 0,5130 0,4590 0,3650 0,7 0,6
Absorbansi
0,5 y = -0,007x + 0,6539 R² = 0,988
0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
10
20
30
konsentrasi GlCNAc
40
50
Lampiran 3. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA)
Abs terkoreksi
0 20 40 60 0 100
0 0.1355 0.2065 0.302 0.376 0.4465
Absorbansi
BSA (µgram)
0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
y = 0,0044x + 0,0266 R² = 0,9877
0
20
40
60
Konsentrasi BSA
80
100
Lampiran 4. Pembuatan Larutan Schales
Potasium Ferisianida
0,25
g
Na2CO3
26,4975 g
Dilarutkan dalam 500 ml akuades
Distirer
Dituang ke dalam botol kaca
Disimpan dalam kulkas
Lampiran 5. Uji Aktivitas Kitinase Modifikasi Spindler (1997) Substrat
Sampel Kontrol
Koloidal Kitin 0,3 %
300 μl
300 μl
Penyangga fosfat 50
200 μl
200 μl
100 μl
0 μl
mM Enzim
Diinkubasi pada suhu 37 ᴼC selama 30 menit Keterangan
Kontrol
Enzim yang setelah dipanaskan selama 10
100 μl
menit
Dididihkan 10 menit Disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit Substrat
Sampel Kontrol
Blanko
Campuran enzim diambil
300 μl
300 μl
-
Akuades
700 μl
700 μl
1000 μl
Schales
1000 μl
1000 μl
1000 μl
Vortex Dididihkan pada suhu 100 ᴼC selama 10 menit Didinginkan Diukur λ = 420 nm Hasil
Rumus :
Aktivitas enzim = ((konsentrasi sampel – konsentrasi blanko) – (Konsentrasi kontrol – konsentrasi blanko)) X 600 : Enzim Akhir X 1000 : Enzim awal X 1 : menit X 1 : BM kitinase.
Total aktivitas enzim : aktivitas enzim (Unit/mL) x volume enzim (mL) Total protein : protein (mg/mL) x volume enzim (mL) Aktivitas spesifik Unit/mg = Total aktivitas enzim (Unit/mL) Total protein (mg/mL) Hasil % = Total aktivitas n Total aktivitas 0
X 100
Tingkat kemurnian (kali) = Aktivitas spesifik n Aktivitas spesifik 0
Lampiran 6. Metode Penentuan Kadar Protein (Bradford, 1976).
Pereaksi Akuades Enzim Reagen Bradford
Divorteks
Campuran diukur pada λ 595 nm
Blanko (ml) 0,5 0 0,75
Sampel (ml) 0 0,5 0,75
Lampiran 7. Komposisi Reagen Bradfrod & Pembuatan Ragen Bradford
A. Larutan Stock Bradford Comassie Blue G-250 Etanol 95% H3Po4 88% Distirer Disaring dengan kertas saring
B. Pembuatan Reagen Bradford 425 ml akuades 15 ml 95% Etanol 35 ml 88% fosfat 30 ml larutan Stock Distirer Disaring dengan kertas saring Dimasukkan dalam Botol Kaca Disimpan dalam kulkas
70 mg 20 ml 40 ml
Lampiran 8. Perhitungan Parameter Km dan Vmaks 0,07 y = 0,0045x + 0,014 R² = 0,9769
0,06
1/ V
0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0
5
10
1/s
PERSAMAAN LINEAWER-BURK= 1/Vmaks= Vmaks = Km/Vmaks = Km= kemiringan= 1/<s>= 0, 1/v 1/Km= (-)1/Km, 1/v=0
0.0045X + 0.014 0.014 71.4286 0.0045 0.3214 0.0045 0, 0.0045 3.1 (-)0.321,0
15
Lampiran 9. Data Hasil Sequencing Identifikasi Isolat JP2 dengan Menggunakan Gen Penyandi 16S rRNA
GGGGGCAAGGGGCTGCTCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG TAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATG CTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTTCA AGATGGACCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCG ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTC TGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTT GTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAA GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGA TGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAG TGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGC GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG ATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC TTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGG GCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCA CTCTAAGGTGACTGCCCGGTGACAAACCCGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAA ATCATCATGGCCCCTTATGACCTGGGGCTACCCACCGGGTACAATGGGCAGAAC AAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTC GGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAT CAGCATGCGGGGGGGGGT
