INFEKČNÍ SÉROLOGIE Bakteriologie
IMUNOENZYMATICKÉ SOUPRAV Y K DIAGNOSTICE INFEKCE HELICOBACTER PYLORI Helicobacter pylori ELISA a IMUNOBLOT soupravy jsou určeny ke stanovení specifických protilátek třídy IgA, IgG a IgM v lidském séru nebo plazmě
Úvod
Helicobacter pylori řadíme do rodu Helicobacter. Morfologicky se jedná o gramnegativní, aerobní mikroaerofilní tyčky. Jako patogen se uplatňuje při infekcích žaludeční sliznice, a to zejména v oblasti antra a duodena. Je původcem chronické gastritidy typu B, na jejímž podkladě se může později rozvinout vředová choroba. U tohoto onemocnění je H. pylori prokazován takřka ve 100% případů. Infekce H. pylori je často provázena dyspeptickými potížemi. Aktivní chronická gastritida může přejít ve formu atrofickou s rizikem vzniku žaludečního karcinomu. Faktory patogenity H. pylori vycházejí jednak ze samotné morfologické struktury bakteriální buňky (spirální tvar, bičíky) a dále ze schopnosti produkce extracelulárních enzymů a cytotoxinů (např. ureáza, kataláza, proteázy, VacA, CagA). Vyskytuje se řada patogenních a fakultativně patogenních kmenů. Jejich virulence se liší jednak zastoupením výše zmíněných faktorů, tak i jejich množstvím. Na patogenezi onemocnění se podílí i odpověď hostitele. Rezistentní kmeny se izolují hlavně od neúspěšně léčených osob.
Diagnostika onemocnění Metody k detekci lze rozdělit na invazivní a neinvazivní. K nejužívanějším invazivním metodám patří histologické a cytologické vyšetření z bioptického vzorku žaludeční sliznice a rychlý ureázový test. K neinvazivním metodám patří dechový test a sérologické metody (stanovení protilátek třídy IgA, IgG, IgM). Neinvazivní testy jsou vhodné pro sledování efektivity terapie, vyhledávání infekce a reinfekce. Eradikace mikroba je následována poklesem hladiny protilátek. Vysoce specifické a citlivé metody molekulární biologie (PCR) se provádějí pouze na specializovaných pracovištích.
Diagnostický význam jednotlivých tříd protilátek IgM Jsou zvýšeny zejména v akutní fázi onemocnění, nevyskytují se však u všech nemocných.
IgA Protilátky jsou přítomny nejen v akutní fázi onemocnění, ale i při chronické infekci žaludeční sliznice spolu s protilátkami třídy IgG. Jejich zvýšení je popsáno také u pacientů s rizikem karcinomu žaludku.
IgG Přítomnost potvrzuje kontakt s H. pylori, není však indikátorem aktivity infekce. Sérokonverze nastává cca 2 měsíce po primoinfekci.
ELISA Použití souprav
Pracovní postup
Vyhledávací test k průkazu specifických IgA, IgG a IgM protilátek v lidském séru nebo plazmě
Krok č.
Semikvantitativní výsledky lze použít ke kontrole úspěšnosti terapie Diagnostika fáze onemocnění
Princip testu Soupravy jsou založeny na sendvičovém typu ELISA metody.
Kroky testu
1
Ředění vzorků
2
Dávkování kontrol a ředěných vzorků 100 µl
3
Inkubace 30 min. při 37 °C
4
Odsátí a promytí jamek 5 krát
5
Dávkování Konjugátu 100 μl
6
Inkubace 30 min. při 37 °C
7
Odsátí a promytí jamek 5 krát
8
Dávkování substrátu (TMB-Complete) 100 μl
9
Inkubace 15 min. při 37 °C
séra/plazmy (1+100)
včetně blanku
včetně blanku
Sandwich ELISA
HRP
HRP
HRP
Anti-Hu IgA
Anti-Hu IgM
Anti-Hu IgG
IgG
IgM IgA
Ag
Ag
včetně blanku
10
Dávkování Zastavovacího roztoku 100 μl
11
Fotometrické měření při 450 nm
včetně blanku
Ag
Uživatelský komfort Mikrotitrační destička
Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené reagencie
Antigeny
Zaměnitelnost komponent Barevně značené stripy s odlamovacími jamkami
Klinicky signifikantní kmen H. pylori s vysokým obsahem proteinů CagA (120 kDa) a VacA (87 kDa)
CUT-OFF kontrola a kalibrátory Semikvantitativní hodnocení výsledků (Index pozitivity-IP) nebo kvantitativní vyhodnocení výsledků (U/ml)
Výhody souprav
Charakteristiky souprav ELISA
Diagnostická Diagnostická citlivost specifita
EIA Helicobacter MONO IgA
98,7 %
98,8 %
EIA Helicobacter MONO IgG
98,9 %
98,8 %
Vysoká diagnostická účinnost Dobrá reprodukovatelnost Vysoká dynamika testů Identický pracovní postup Celková doba vyšetření 1,5 hodiny Možnost kvantitativního stanovení
EIA Helicobacter MONO IgM
97,5 %
97,4 %
Vhodné pro otevřené automatické systémy Možnost nezávislé verifikace (CKS) Komplexní zákaznický servis
IMUNOBLOT Použití souprav Konfirmační test k průkazu protilátek proti H. pylori
Antigeny
Princip testu Elektroforeticky separované antigeny H. pylori jsou přeneseny na nitrocelulózovou membránu.
P
E
Po přidání substrátu vzniká reakcí s enzymem nerozpustný barevný produkt
Faktory patogenity: CagA - cytotoxický protein (Cytotoxin Associated Genproduct)
- Mw = 120 kDa
- anti-CagA protilátky dlouhodobé přetrvávání
Cut-off line Start 120 kDa, Cag A 87 kDa, Vac A
VacA - vakuolizační cytotoxin - Mw = 87 kDa
Enzymem konjugovaná sekundární protilátka se váže na primární protilátku Specifická primární protilátka se váže na protein
Specifický protein antigenu Ag
Průkaz protilátek proti antigenu CagA
Blokátor
Nespecifický protein antigenu
Ag
Strip
Anti-Hu IgG (IgA): AP-labeled anti-human IgG (IgA) antibody
CagA a VacA jsou exprimovány asi u 40 – 60% kmenů H. pylori. Vysoce specifické antigeny: Vnější membránové proteiny 19 kDa, 33 kDa Protein 26 kDa Malé ureázové podjednotky ureA = 30 kDa protein 29 kDa
33 kDa 30 kDa 29 kDa 26 kDa 19 kDa 17 kDa
Charakteristiky souprav
Uživatelský komfort Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené reagencie Zaměnitelnost komponent
Immunoblot
Diagnostická citlivost
Diagnostická specifita
BLOT Helicobacter pylori IgA
96,2 %
97,5 %
BLOT Helicobacter pylori IgG
98,5 %
98,9 %
Negativní a Pozitivní kontrola Kontrolní linie na stripu Možnost softwarového vyhodnocení
Pracovní postup Kroky testu
1
Dávkování Univerzálního roztoku 2 ml
2
Smáčení stripů 10 min. při lab. teplotě
3
Odsátí
4
Ředění vzorků
5
Dávkování kontrol a ředěných vzorků 1,5 ml
6
Inkubace 60 min. při lab. teplotě
7
Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min.
8
Dávkování Konjugátu 1,5 ml
Vysoká diagnostická účinnost Vhodné pro automatické systémy
třepačka
Komplexní zákaznický servis
séra/plazmy (40 µl+1,5 ml)
třepačka
Klinická data Korelace výsledků mezi rychlým ureázovým testem, EIA a Imunoblotem (TestLine)
Inkubace 60 min. při lab. teplotě třepačka
10
Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min.
11
Dávkování substrátu (BCIP/NBT) 1,5 ml
12
Inkubace 10 min. při lab. teplotě
13
Odsátí a promytí v destilované vodě 2 krát 2 ml po 5 min.
11
Nalepení a vyhodnocení stripů
třepačka
třepačka
třepačka
UREASAtest
EIA Helicobacter MONO
BLOT Helicobacter pylori
negativní (n=38)
negativní (32)
negativní (38)
pozitivní (n=29)
pozitivní (29)
pozitivní (29)
negativní (n=35)
negativní (32)
negativní (34)
pozitivní (n=30)
pozitivní (30)
pozitivní (30)
negativní (n=23)
negativní (21)
negativní (23)
pozitivní (n=20)
pozitivní (9)
pozitivní (20)
IgA
třepačka
IgG
9
Jednoduchá interpretace a reprodukovatelnost výsledků
IgM
Krok č.
Výhody souprav
INFEKČNÍ SÉROLOGIE Objednací údaje ELISA
IMUNOBLOT
Kód
Název soupravy
HMA096
EIA Helicobacter MONO IgA
HMG096
Počet testů
Kód
Název soupravy
Počet testů
96
HpAB16
BLOT Helicobacter pylori IgA
16
EIA Helicobacter MONO IgG
96
HpGB16
BLOT Helicobacter pylori IgG
16
HMM096
EIA Helicobacter MONO IgM
96
SwIm03
Immunoblot Software
xxxTLN
CKS negativní (dle seznamu na www.testlinecd.cz)
3,5 ml
xxxTLP
CKS pozitivní (dle seznamu na www.testlinecd.cz)
3,5 ml
1 ks
Kontakt
TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. Křižíkova 68 612 00 Brno, Česká republika Tel.: +420 549 121 205 (237, 238) Fax: +420 541 243 390 E-mail:
[email protected]
www.testlinecd.cz
TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. je držitelem certifikátů ISO 9001:2008 a ISO 13485:2003.
