Doktori (PhD) értekezés
KAJSZIFAJTÁK GENETIKAI ANALÍZISE DNS-ALAPÚ MARKEREKKEL
Ruthner Szabolcs
Témavezetı: Dr. Pedryc Andrzej, CSc egyetemi tanár
Budapesti Corvinus Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék
Budapest 2010
A doktori iskola
megnevezése:
Kertészettudományi Doktori Iskola
tudományága:
Növénytermesztési és kertészeti tudományok
vezetıje:
Dr. Tóth Magdolna egyetemi tanár, DSc Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Gyümölcstermı Növények Tanszék
Témavezetı:
Dr. Pedryc Andrzej egyetemi tanár, CSc Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Genetika és Növénynemesítés Tanszék
A jelölt a Budapesti Corvinus Egyetem Doktori Szabályzatában elıírt valamennyi feltételnek eleget tett, az értekezés mőhelyvitájában elhangzott észrevételeket és javaslatokat az értekezés átdolgozásakor figyelembe vette, ezért az értekezés védési eljárásra bocsátható.
.................................................. Dr. Tóth Magdolna Az iskolavezetı jóváhagyása
.................................................. Dr. Pedryc Andrzej A témavezetı jóváhagyása
A Budapesti Corvinus Egyetem Élettudományi Területi Doktori Tanácsának 2009. december 9-i határozatában a nyilvános vita lefolytatására az alábbi bíráló Bizottságot jelölte ki:
BÍRÁLÓ BIZOTTSÁG:
Elnöke Hrotkó Károly, DSc
Tagjai Höhn Mária, CSc Szabó Zoltán, DSc Szalay László, PhD Zámboriné Németh Éva, DSc Opponensek Kiss Erzsébet, CSc Palkovics László, DSc Titkár Höhn Mária, CSc
„A kajszi is leszedve rég, folyékony arannyá fıtt. Langy körte és dicsı ıszibarack pompáz a törpe fákon, roncs férj karján virágzó húsú nı.„ /Babits Mihály/
1
TARTALOMJEGYZÉK 1
BEVEZETÉS........................................................................................................... 5
2
IRODALMI ÁTTEKINTÉS .................................................................................. 6 2.1
Kajszifajták általános jellemzése, ökoföldrajzi csoportosítása......................... 6
2.2
Molekuláris markerezés .................................................................................... 8
2.2.1 2.3
A molekuláris markerek fogalma, típusai, általános jellemzıi................. 9 Izoenzim markerek ......................................................................................... 11
2.3.1
Izoenzimek a Prunus nemzetségben....................................................... 12
2.3.1.1 2.4
Izoenzimek alkalmazása a kajszi esetében ......................................... 13
Az RFLP markerek ......................................................................................... 14
2.4.1
RFLP markerek alkalmazása a Prunus fajokban .................................... 15
2.5
PCR – polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)............................ 17
2.6
RAPD-polimorfizmus..................................................................................... 18
2.6.1
RAPD-polimorfizmus kimutatása a Prunus nemzetségben.................... 19
2.6.1.1
İszibarack .......................................................................................... 19
6.1.1.2
Mandula .............................................................................................. 20
6.1.1.3
Szilva .................................................................................................. 20
6.1.1.4
Cseresznye .......................................................................................... 21
2.6.1.5
RAPD-polimorfizmus vizsgálata kajszibaracknál .............................. 22
2.7
Az AFLP markerek ......................................................................................... 25
2.7.1
AFLP markerek alkalmazása a Prunus fajoknál......................................... 25
2.8
Mikroszatellit markerek .................................................................................. 28
2.8.1
A mikroszatellit markerek jellemzıi, funkciója és evolúciója ............... 28
2.8.2
A mikroszatellit markerek alkalmazhatósága a növényekben ................ 30
2.9
Mikroszatellit markerek használata a Prunus nemzetségben ......................... 31
2.9.1
Mikroszatellit régiók azonosítása és primerfejlesztés............................. 31
2.9.2
Mikroszatellit markerek alkalmazása a fontosabb Prunus fajokban. ..... 33
2.9.2.1
İszibarack .......................................................................................... 33
2.9.2.2
Cseresznye és meggy .......................................................................... 35
2.9.2.3
Mandula .............................................................................................. 35
2.9.2.4
Szilva .................................................................................................. 36
2.9.2.5
Kajszi .................................................................................................. 37
2
3
A KUTATÁS ELİZMÉNYEI ÉS CÉLJAI ....................................................... 43
4
ANYAG ÉS MÓDSZER....................................................................................... 45
5
4.1
Növényanyag .................................................................................................. 45
4.2
DNS-izolálás ................................................................................................... 45
4.3
RAPD analízis................................................................................................. 45
4.4
SSR analízis fajtaazonosítási céllal................................................................. 52
4.5
SSR analízis ıszibarack mikroszatellit primerekkel....................................... 53
4.6
SSR analízis kajszi mikroszatellit primerekkel .............................................. 55
EREDMÉNYEK ................................................................................................... 57 5.1
DNS kivonási eljárás adaptálása kajszira ....................................................... 57
5.2
Magyarországon termesztett fı kajszifajták analízise RAPD markerekkel.... 58
5.3
Magyarországon termesztett fı kajszifajták analízise SSR markerekkel ....... 59
5.4
Az ıszibarackra tervezett SSR primerkészlet alkalmasságának vizsgálata
kajszi mikroszatellit régiók variabilitásának kimutatására ......................................... 63 5.5
Kajszi genomokra tervezett SSR régiók variabilitásának elemzése egy széles
genetikai bázisú kajszifajta csoporton ........................................................................ 66
6
5.5.1
A fajták közötti genetikai kapcsolatok vizsgálata................................... 69
5.5.2
Ökoföldrajzi csoportok és a rokon fajok közötti genetikai kapcsolat..... 69
EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA .................................................................... 72 6.1
DNS-kivonási eljárás adaptálása kajszira ....................................................... 72
6.2
A Magyarországon legnagyobb területen termesztett fajták azonosítása és
egyedi DNS-ujjlenyomat készítése RAPD és SSR markerekkel................................ 74 6.2.1
Jellemzés RAPD markerekkel ................................................................ 74
6.2.2
Jellemzés SSR markerekkel.................................................................... 76
6.3
İszibarack SSR primerek használata 45 kajszigenotípus jellemzésére ......... 77
6.3.1
A felhasznált primerek alkalmassága és a polimorfizmus jellemzıi...... 77
6.3.2
A vizsgált fajták genetikai kapcsolatának elemzése ............................... 78
6.3.3
A felhasznált elválasztási technika jellemzıi ......................................... 79
6.4
Kajszi SSR markerekkel vizsgált 136 genotípus azonosítása és genetikai
kapcsolatuk, származásuk elemzése ........................................................................... 80 6.4.1
A felhasznált primerek alkalmassága és a polimorfizmus jellemzıi...... 80
3
6.4.2
A kajszi genetikai változékonysága és fajták közötti genetikai
kapcsolatok ............................................................................................................. 82 6.4.3
A kajszi és néhány rokon faj genetikai kapcsolatának elemzése
klaszteranalízissel ................................................................................................... 86 6.4.4
Ökoföldrajzi csoportok közötti genetikai viszony .................................. 86
7
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ............................................................... 88
8
ÖSSZEFOGLALÁS.............................................................................................. 89
9
SUMMARY ........................................................................................................... 91
10
MELLÉKLET................................................................................................... 93 M1.
Irodalomjegyzék ............................................................................................. 93
M2.
DNS-kivonási protokollok ............................................................................ 112
4
1
BEVEZETÉS Magyarországon több évszázados hagyománya van a kajszi termesztésének. A
magyar kajszi kiváló tulajdonságait külföldön is elismerik, és hungarikumként tartják számon. Tradícióból és hírnévbıl azonban sokáig megélni nem lehet, a piaci lehetıségeket ezért csak úgy lehet kihasználni bel- és külföldön egyaránt, ha kiváló minıségő gyümölcsöt termesztünk. Ehhez megvannak a megfelelı termıhelyeink, kiváló beltartalmi értékekkel rendelkezı hagyományos fajtáink és a szakmai tudás. A változó fogyasztói szokásokkal és piaci igényekkel azonban csak úgy tudunk lépést tartani, ha a termesztést folyamatosan fejlesztjük. Az innovációs tevékenységnek minden részletre ki kell terjednie a termıhelyi alkalmasság meghatározásától a technológia kidolgozásán keresztül az értékesítésig. Ezen belül meghatározó jelentısége van a fajtahasználatnak. A magyar termesztık rendelkezésére álló fajtaválaszték sajnos csak lassan bıvül, pedig nagy szükség lenne a sarkavírussal szemben rezisztens és a kereskedelmi céloknak megfelelı új fajtákra, ami a világon már több helyen elérhetı. Jelenleg két helyen folyik kajszinemesítés Magyarországon: Cegléden a Gyümölcstermesztési Kutató-Fejlesztı Intézetben, ahol nemes fajták és alanyok elıállításával
is
foglalkoznak,
illetve
Budapesten
a
Corvinus
Egyetem
Kertészettudományi Karának Genetika és Növénynemesítés Tanszékén. Az Egyetemen korszerő biotechnológiai módszereket is alkalmazunk a nemesítésben. A génforrások tulajdonságainak
elemzésében
és
molekuláris
markerekkel
történı
megkülönböztetésében jelentıs eredményeket értünk el, amelyek hozzájárulhatnak a nemesítımunka sikeréhez. A nemesítési folyamatok felgyorsításának egyik eszköze a DNS-markerekre alapozott szelekció. Viszonylag egyszerően és egyértelmően azonosítható, változatos allélösszetételő, ismert szabályok szerint öröklıdı markerlókuszok segítségével megvalósítható a fajtákban rejlı genetikai polimorfizmus kutatása, a fajták eredetének és rokonsági kapcsolatainak vizsgálata, fajták azonosítása. A nemesítıi szellemi tulajdon védelmében, a fajtaazonosítási céllal használt molekuláris markerek szerepe fokozatosan felértékelıdik. Így a technika nagymértékben könnyítheti a nemesítıket illetı fajtahasználati díj begyőjtését, ami alapját képezheti a késıbbi nemesítési programoknak.
5
2
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1
Kajszifajták általános jellemzése, ökoföldrajzi csoportosítása A kajszi a Rosaceae család, Prunoideae alcsalád Prunus L. nemzetségébe
tartozik. A legtöbb termesztett kajszifajtát a Prunus armeniaca L. faj adja. Vavilov (1926; 1951) a kajszi származási központjaként Kína északi, észak-keleti hegységeit jelölte meg. A vad kajsziformákban gazdag Tien-san, valamint Dzsungária hegységei másodlagos géncentrumnak tekinthetık (1. táblázat) (Mehlenbacher és mts., 1991). A kajszifajták négy különbözı földrajzi csoportba sorolhatók: ázsiai, kaukázusi, európai és a dzsungár-altáji (Kosztina, 1969), melyeket késıbb a kínai és a kelet-kínai csoportokkal egészítettek ki (Bailey és Hough, 1975). Az Európában, ÉszakAmerikában, Dél-Afrikában és Ausztráliában termesztett fajták túlnyomó része egyaránt az európai csoportba sorolható. Ez a csoport számít a termesztési szempontból jelentıs négy csoport közül a legfiatalabbnak és a legkevésbé változékonynak.
1. táblázat: A kajszi ökoföldrajszi csoportjai (Mehlenbacher és mts., 1991)
Csoport
Alcsoport
Fajták
1. Dzsungár-Zaili
Dzsungári Zailij
2. Közép-ázsiai
Fergani
helyi fajták helyi fajták Boban, Kecs-psar, Khurmai, Kandak, Suphani, Isfarak, Mirsandshali Badami, Ahrori, Arzami, Sadifak, Iska-dari, Tuliaki, Khosravshai Kok-psar, Szamarkandszkij szamji rannij
Zerevsani Szamarkandi Sahrisyabzi Horezmi Kopet-dagi 3. Irano-kaukázusi
Iráni-kaukázusi
4. Európai
Dagesztáni Észak-afrikai Nyugat-európai Kelet-európai Észak-európai
5. Észak-kínai 6. Tibeti 7. Észak-kelet kínai 8. Kelet kínai
Kizil-nukul, Ak-nukul, Kizil-Palvan Ashkhabad Salah, Spitak, Malayer, Damavand, Hacihalioglu Hekobrash, Honobah Hamidi, Bedri, Baour, Amor Leuch, Laribi Canino, Montedoro, Veecot, Royal, Moniqui Magyar kajszi Zserdeli magoncok P. armeniaca P. armeniaca var. holosericea P. armeniaca, P. sibirica, P. mandshurica P. armeniaca var. ansu
6
Amíg a kajszi elsıdleges géncentrumában található kínai és közép-ázsiai fajták nagy része (Mehlenbacher és mts., 1991), a török fajták 60%-a (Paydas és mts., 2006), a magyar származású fajták közel 20%-a önmeddı, addig a nyugat-európai tradicionális fajták között alig fordul elı önmeddı genotípus (Mehlenbacher és mts., 1991). Ezek alapján az öntermékenyülı jelleget kialakító mutáció valószínőleg a kajszi elterjedésének útvonalán, a Kína és Törökország közötti földrajzi térségben következhetett be. Mind a kajszi, mind az ıszibarack kultúrevolúciója során kiemelik a Tien-san vidékét, a Fergánai-medencét és Dzsungária környékét, melyek a magashegyi környezet, erıs UV-sugárzás, szélsıséges hıingadozás és csapadékeloszlás révén jelentısen növelhették a mutációs rátát (Timon, 2000; Surányi, 2003). Magyarországon a kajszit hagyományosan öntermékenyülınek ismerik. Elsıként a hazai fajták közül az 1971-ben elızetesen állami elismerésben részesített ‘Szegedi mammut’-ról derült ki, hogy önmeddı (Brózik és Nyéki, 1975), amit néhány év elteltével az Óriás fajtacsoport többi tagjáról is igazoltak (Szabó és Nyéki, 1991). A világ kajszitermesztésének jelentıs részét az európai ökoföldrajzi csoportba tartozó kajszifajták adják. E csoport tagjainak túlnyomó többsége öntermékenyülı, de éppen ebbıl kifolyólag e csoport genetikai variabilitása igen korlátozott. A piaci igényeknek megfelelı, egyre újabb fajták elıállításának kényszere megköveteli, hogy a nemesítı egyre szélesebb genetikai bázisú alapanyagokat használjon fel nemesítési programjában. Az Egyesült Államokban, illetve Kanadában létrehozott fajtákat gyümölcstömegük, színük miatt nem lehet kihagyni a nemesítési programokból. A közép-ázsiai fajták esetében a magas cukortartalom, aszalványkészítésre való alkalmasság, hosszú mélynyugalmi állapot azok a tényezık, amelyek miatt a különbözı nemesítı mőhelyekben ezek a fajták is potenciális szülıpartnernek számítanak Ezen nemesítési programok hatására Európában is egyre több, széles körben elterjedt, önmeddı fajtát hoztak forgalomba az utóbbi 15 év során (Burgos és mts., 1993; Pedryc, 2003).
7
2.2
Molekuláris markerezés „Az elsı mai értelemben vett és tudományosan megalapozott növénygenetikai
vizsgálatok több mint egy évszázadra, Mendel (1886) borsóval végzett kísérletéig nyúlnak vissza. Az elsı kapcsoltsági vizsgálat Sturtevant (1913) nevéhez főzıdik, aki az ecetmuslica X kromoszómájának kapcsoltsági térképét készítette el 5 morfológiai marker alapján. A ’60-as évek végéig morfológiai, agronómiai és élettani tulajdonságokat meghatározó alléleket használtak genetikai markerként” (Törjék, 2001). „A ’70-es évek elejétıl kezdıdıen a biokémiai markerek csoportjába tartozó izoenzim (Markert és Moller, 1959) és tartalékfehérje markerek terjedtek el, majd a ’80as évektıl jelentek meg a DNS-alapú markerek, és váltak általánossá a genomanalízisben. A DNS-markerek közül korábban a hasítási elven mőködı RFLP, az utóbbi két évtizedben pedig a PCR-alapú technikák terjedtek el” (Törjék, 2001). A morfológiai, izoenzim és DNS-alapú markerek összehasonlítását a 2. táblázat tartalmazza. A fehérje-, illetve DNS-alapú genetikai markereken alapuló technikák használata napjainkra rutinszerővé vált az ökológiai, evolúciós, taxonómiai, filogenetikai és a növényi genomokat érintı gyakorlati felhasználású tanulmányokban. Ezeknek az eljárásoknak az alapprotokolljai már precízen kidolgozottak, az alkalmazásuk elınyei és hátrányai, felhasználásuk potenciális területei jól ismertek. A folyamatosan megjelenı új markerezési módszerek a fenti alaptechnológiák kombinálásán, illetve az adott kutatási célnak megfelelı finomításokon alapulnak. A legújabban kifejlesztett markerek kihasználják az olyan növényi genom komponenseket,
mint
például
a
retrotranszpozonokat,
mitokondriumokat,
kloroplasztiszokat. A következı években a teljes növényi genomokra kiterjedı ismeret gyors ütemő bıvülésével, a markerezési technikák fejlıdésében és a markerek alkalmazásában további jelentıs elırelépések várhatók.
8
2.2.1 A molekuláris markerek fogalma, típusai, általános jellemzıi „A molekuláris markerek a DNS meghatározott szakaszai, amelyek azonosítható kromoszomális lokalizációval rendelkeznek, öröklıdésük a mendeli szabályok alapján követhetı. A marker lehet gén is, de általában ismeretlen funkciójú DNS-szakasz, olyan lókusz a kromoszómán, amely a különbözı genotípusokban eltérı szekvenciákat, a fenotípus kialakításában részt nem vevı, semleges allélokat hordoz. A morfológiai és biokémiai markerektıl eltérıen számuk csak matematikai értelemben nem végtelen, fenotípusos vagy élettani hatásuk általában nincsen” (Kiss, 2005). A markerek jelenlétét nem befolyásolják a környezeti tényezık, pleiotróp és episztatikus hatások. „Az ideális DNS-markerek a következı tulajdonságokkal rendelkeznek: •
nagyfokú polimorfizmus, amely egyenletesen oszlik el a genomban,
•
kodomináns öröklıdés,
•
könnyő hozzáférhetıség, nem igényel elızetes információt a vizsgált genomról,
•
könnyő és gyors vizsgálat,
•
reprodukálhatóság,
•
az adatok egyszerő cserélhetısége a laboratóriumok között.
E követelményeknek egy-egy marker csak részben felel meg. A cél és a feladat határozza meg, hogy mikor melyik marker típust választjuk” (Kiss, 2005). A kertészeti növényeknél leggyakrabban a következı módszereket alkalmazzák: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) véletlenszerően felszaporított polimorf DNS, SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) szekvencia alapján jellemzett marker, SSR (Simple Sequence Repeats) amplifikált mikroszatellit régió, CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) vagy PCR-RFLP hasított és felszaporított fragmentumok polimorfizmusa, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus. A felhasználhatóság szempontjából értékelt, a leggyakrabban használt DNS-alapú markertípusokat a 3. táblázat tartalmazza.
9
2. táblázat: Morfológiai, izoenzim és DNS alapú markerek összehasonlítása fıbb jellemzıik alapján (Moissy-Cramayel, 1994) Jellemzık Kölcsönhatás a környezettel Analizálható növény kora Növényi alapanyag
Morfológiai markerek
Izoenzimek
DNS-alapú markerek
erıs
gyenge
nincs
fiataltól idısig
fiatal
fiatal
teljes növény
minden friss szövet
minden friss vagy liofilizált szövet
Alkalmazható markerek száma A markerek polimorfizmus foka A tanulmányozott genom zónái
kevés
kevés
sok
gyenge
gyenge
jó
kódoló
Kódoló
kódoló és nem kódoló
Az analízis gyorsasága
a fejlıdési fázistól függ
elég gyors
elég gyors
Az eredmények ismételhetısége
változó
jó
többnyire jó
3. táblázat: A DNS-alapú molekuláris markerek összehasonlítása fıbb jellemzıik alapján (Agarwal és mts., 2008) Mőszaki Szükséges ReprodukálPolimorfizLókusz feltételek Gyakoriság hatóság DNSmus mértéke specificitás (költségmértéke mennyiség igény)
RFLP nagymértékő RAPD nagymértékő
nagy kismértékő
közepes közepes
van nincs
nagy kicsi
nagy kevés
SSR
közepes mértékő
közepes
közepes
nincs
közepes
kevés
CAPS
kismértékő
nagy
kismértékő
van
nagy
kevés
SCAR
kismértékő
nagy
közepes
van
közepes
kevés
nagy
közepes
nincs
közepes
közepes
AFLP nagymértékő
Fı alkalmazási területek fizikai térképezés géntérképezés genetikai változékonyság kutatása allél változékonyság kimutatása géntérképezés és fizikai térképezés géntérképezés
10
2.3
Izoenzim markerek Annak ellenére, hogy saját kísérleteimben nem használtam izoenzim, RFLP,
AFLP markereket, e módszerek ismertetése nélkül nem lehet teljes képet adni a molekuláris markerezésrıl. Ez különösen igaz a Prunus nemzetségben, így a kajszinál is, ahol az elıbbiekben említett technikák szerves részét képezik akár RAPD vagy SSR markerekkel végzett kutatásoknak. Nem egyszer egymás kiegészítıi, fıként a nemzetség fizikai és genetikai térképeinek elkészítésekor. Természetesen ezeknél az általam nem használt technikáknál a teljesség igénye nélkül igyekeztem röviden összefoglalni az elmúlt évek legfontosabb eredményeit. Az izoenzimek az elsı olyan molekuláris markerek, amelyet széles körben alkalmaznak a gyakorlati növénynemesítésben, valamint az elméleti kutatásokban egyaránt. Érdemes megjegyezni, hogy eddig ez az egyetlen molekuláris markerezési módszer, amelyet a Vetımag Vizsgálók Nemzetközi Szövetsége (ISTA) hivatalos szabályzata elfogad mint a vetımagtételek fajtaazonosságát bizonyító módszert. Definíció szerint az izoenzimek egy faj olyan multiplex molekuláris enzim formái, amelyeknek a genomban több mint egy enzimstruktúrgén felel meg (Markert és Moller, 1959). Ezek több lókuszt jelölhetnek, vagy egy lókusz több allélformáját képviselhetik. Az izoenzimek genetikai háttere háromféle lehet: •
Hasonló (azonos) mőködést végzı enzimet kódolhat több különbözı gén (lókusz).
•
Mutáció eredményeként azonos lókusz több allélikus formája jöhet létre egy genomban.
•
Az egyedfejlıdés során egy-egy sejtvonalban szomatikus mutáció eredményeként is keletkeznek fehérjeszerkezeti változások, amelyek egyedi eltérést eredményeznek, és ivaros úton nem adódnak tovább (Hajósné, 1999). Az izoenzimek, mivel különbözı méretőek és töltésőek, elektroforetikus úton
keményítı- vagy poliakrilamidgélen elválaszthatók. Az izoenzimeket számos célra alkalmazhatjuk, mint például fajtaazonosság ellenırzésére, biokémiai géntérképek készítésére,
génexpresszió
tanulmányozására.
Az
izoenzimeknek
széleskörő
felhasználhatóságuk ellenére vannak hiányosságaik: kevés a térképezett izoenzim lókusz, szők genetikai bázisú beltenyésztett anyagokban kevés a polimorf lókusz,
11
valamint a legfontosabb, hogy nem minden DNS szinten bekövetkezı változás detektálható fehérjeszinten is. A növényi enzimkutatás már a ’60-as években elindult. Elsıként Schwartz (1960) közölte a hibridkukorica egyes enzimjeivel kapcsolatos tapasztalatait. A technikát azonban igazából csak a ’70-es évek végétıl kezdték el intenzívebben alkalmazni, miután felfedezték, hogy az izoenzim-variabilitás nemcsak egyedszinten, hanem a populációkon belül is kimutatható. Fás növényekben elıször Adams (1983) használt izoenzimeket fenyıfajták nemesítési célú azonosítására. Ugyanebben az évben Torres (1983) az izoenzimeket különbözı gyümölcsfajokon a fajták azonosítására és a hibridek eredetének alátámasztására használta.
2.3.1 Izoenzimek a Prunus nemzetségben A csonthéjas gyümölcső fajokon Arulsekar és mts. (1986) közölték az elsı izoenzimekkel végzett kutatást. A technika alacsony költsége és viszonylag egyszerő kivitelezhetısége miatt alkalmazása ebben a fajkörben is viszonylag gyorsan elterjedt. Ugyanakkor a kisszámú vizsgálható lókusz és a korlátozott mértékő allélvariabilitás viszonylag hamar kijelölte a technika korlátait. A nemzetségen belül jelentıs eltérés tapasztalható az izoenzim markerek polimorfizmusa tekintetében az öntermékenyülı és az idegentermékenyülı fajok között. Az idegentermékenyülı fajok nagyobb allélváltozatossággal rendelkeznek, így jelentıs mértékő polimorfizmust sikerült kimutatni ıszibarack és mandula hibridek (Byrne és Littleton, 1988) és mandula esetében (Arulsekar és mts., 1986). Az öntermékenyülı, ebbıl kifolyólag jelentıs mértékben beltenyésztett ıszibarack fajtáknál jóval kisebb mértékő polimorfizmust lehetett találni (Durham és mts., 1987). Egy konkrét összehasonlító vizsgálatban Arulsekar és mts. (1986) ezt megfelelıen demonstrálták, amikor mandula- és ıszibarackfajtákat jellemeztek 12 különbözı enzimlókusz segítségével. A mandulánál a tizenkét enzimbıl kilenc enzim polimorf mintázatot mutatott, az ıszibaracknál csupán egy esetben fordult ez elı. Az izoenzimek megjelenése egy új eszközt adott a genetikusok kezébe az egyes allélok öröklıdésmenetének meghatározására. Tulajdonképpen ezek a kutatások a MAS (Marker Assisted Selection) elıfutárainak is tekinthetık. A Prunus nemzetségben ilyen célú vizsgálatokat elıször Mowrey és Werner (1990) végeztek, amikor egy ıszibarack ×
12
mandula hibridpopulációban három lókusz izoenzimjeinek öröklıdését figyelték meg. Goffreda és mts. (1991) az elızı vizsgálathoz hasonlóan 5 izoenzim lókusz öröklıdését vizsgálták meg interspecifikus hibrideken. Az
izoenzimek,
mint
az
egy-egy tulajdonságot
meghatározó
lókuszok
változatainak vizsgálata, jelentıs módon hozzájárultak a Prunus fajok genetikai ismereteinek bıvítéséhez, illetve ezt követıen konkrét nemesítési célokhoz történı felhasználásukhoz. Több vizsgálat is fényt derített arra, hogy rokon Prunus fajokon ugyanazt a tulajdonságot egyik esetben egy multi-lókuszos bonyolult enzimrendszer határozza meg, míg a másik fajnál ugyanezért egy egyszerő rendszer felel. Byrne és Littleton (1989a) kajszi almasav-dehidrogenáz (MDH) enzimerendszerét vizsgálta ilyen szempontok szerint. A hibridkukorica vetımagelıállításokban ma már rutinszerően használják az izoenzimeket az F1 vetımagok tisztaságának ellenırzésére, a szülıi típusok kiszőrésére. Ez ma már elengedhetetlen eszköz, mivel a szántóföldi posztkontroll vizsgálatok eredményének ismeretekor az adott vetımagtétel már elvetésre került, visszahívására nincsen mód. A Prunus fajoknál eltérı célból, de hasonló elvek szerint használtak izoenzimeket az interspecifikus hibridek eredetének meghatározására. Két ilyen típusú vizsgálatra is sor került. Elsıként ıszibarack és mandula hibrideket, majd japánszilva és kajszi hibrideket (plumcot) különítettek el a szülıi típusoktól peroxidáz izoenzimjeik segítségével (Byrne és Littleton, 1988; Byrne és Littleton, 1989b). Érdemes kuriózumként még megemlíteni azt a cseresznye hibridpopuláció alapján szerkesztett géntérképet, amely csak izoenzimmarkereket tartalmaz (Bošković és mts., 1997).
2.3.1.1 Izoenzimek alkalmazása a kajszi esetében Az izoenzimrendszerek vizsgálatának eredményeit a kajszinál elıször Byrne és Littleton (1989a) tették közzé. Hatvankilenc különbözı eredető – európai, közép-ázsiai és észak-kínai – fajtát és hibridet vizsgáltak. A hét enzimlókusz közül három bizonyult polimorfnak. Néhány fajta egyedi izoenzim-mintázatot mutatott. A kajszi izoenzim polimorfizmusának mértéke elmaradt a szilvára és mandulára jellemzı értékektıl, meghaladta viszont az ıszibarackra jellemzı értéket (Byrne és Littleton, 1989a; Byrne, 1989). Battistini és Sansavini (1991) négy polimorf enzimlókusz elemzésével 50
13
kajszifajtát 16 egyedi mintázatú csoportba sorolt. Badenes és mts. (1998) tíz enzim izoenzim mintázatát vizsgálva eredet szerint három földrajzi csoportba – északamerikai, iráni-kaukázusi és európai – tudtak besorolni 94 fajtát. Manganaris és mts. (1999a) lényegesen nagyobb mértékő polimorfizmusról számoltak be, bár ennek oka abban is keresendı, hogy 17 kajszifajta mellett 56 interspecifikus keresztezésekbıl származó hibridet is bevontak kísérleteikbe. A 20 enzimlókusz közül 17 bizonyult polimorfnak. Ezeknek a vizsgálatoknak alapvetı hiányossága - ami miatt eredményeik nem használhatók az egész fajra jellemzı polimorfizmus vagy heterozigótaság jellemzésére - a kutatók rendelkezésére álló viszonylag szők genetikai hátteret reprezentáló genotípusokban keresendı (Badenes és mts., 1998; Manganaris és mts., 1999b). Sikeresnek ítélhetı az izoenzimmintázat elemzésének alkalmazása az interspecifikus hibridek és a szülıi genotípusok elkülönítésére. Az elızı fejezetben említetteken kívül sikerült még azonosítani pluot és aprium hibrideket (Byrne és Littleton, 1989b; Manganaris és mts., 1999a). A DNS alapú markeres kutatásokat megelızıen a Genetika és Növénynemesítés tanszéken is folytak izoenzim markerekkel végzett kutatások. Janke (1996) különbözı izoenzimek változékonyságát vizsgálta hagyományos kajszifajtáknál.
2.4
Az RFLP markerek Az elsı DNS-markerek enzimatikus hasítás útján létrehozott fragmentumok
voltak. A hasítási fragmentumhossz polimorfizmusokat (RFLP) markerként lehet felhasználni genetikai kapcsoltsági térképek szerkesztéshez. Használatukkal a térképezés lényegesen rövidebb idı alatt és könnyebben elvégezhetı, mint a morfológiai markerek esetében volt. Annak ellenére, hogy a technika elemei már a hetvenes évek közepén rendelkezésre álltak, molekuláris markerként történı felhasználásáról és a markerek felhasználásával térkép készítésérıl csak a ’80-as évek elején számoltak be (Botstein és mts., 1980). A növényi genom 108-1011 bp közötti mérete miatt a 4, illetve 6 bp felismerı enzimek olyan sok fragmentumra hasítanák a DNS-t, hogy éles elválasztásuk nem lenne lehetséges. A restrikciós helyek eloszlásában az egyes genotípusokban meglévı különbségeket, - amelyeket inszerció, deléció, pontmutáció okoz - csak akkor lehet detektálni, ha jelölt próbával hibridizáltatjuk a fragmentumokat. A próba lehet a genomi
14
DNS egy szakasza, cDNS, vagy szintetikus oligonukleotid. A hibridizáció technikáját Southern (1975) dolgozta ki. Az RFLP-vel detektált változékonyság, elsısorban nem a DNS-t hasító endonukleázoktól, hanem a próba DNS hibridizációs képességétıl függ.
2.4.1 RFLP markerek alkalmazása a Prunus fajokban Az RFLP markereket a Prunus fajokban elsısorban géntérképezési célokra használták. A technikával elvileg korlátlan számú marker hozható létre, ami rendkívül elınyös tulajdonság a kapcsoltsági térképek kialakításánál. Különösen igaz ez a Prunus nemzetségben, ahol viszonylag kicsi a genetikai variabilitás mértéke. A kilencvenes évek elején kezdıdtek az elsı vizsgálatok ıszibarackban, ahol Eldredge és mts. (1992) 16 RFLP markert teszteltek két hasadó nemzedékben. A morfológiai és az RFLP markerek között ugyan kapcsoltságot nem találtak, csak két RFLP marker kapcsolatát tudták igazolni. Az igazi áttörést Rajapaske és mts. (1995) vizsgálata hozta, amikor 8 kapcsoltsági csoportban 46 RFLP markert helyezett el az ıszibarack genetikai térképén. Elsıként morfológia markerekhez (pl. gyümölcshús szín) kapcsolt RFLP markereket azonosítottak. A ’90-es évek közepétıl felgyorsultak az események, és sorra jelentek meg a nemzetségben közölt RFLP térképek: ıszibarack × mandula hibridek (Fooland és mts., 1995), mandula (Viruel és mts., 1995) és meggy (Wang és mts., 1998) hasadó nemzedékeinek felhasználásával. Ebben az évtizedben szinte kizárólag RFLP-alapú térképek készültek, amik csak elvétve egészültek ki RAPD markerekkel. Elvétve találni forrást arra vonatkozóan, hogy a nemzetségben használtak RFLP markereket fajtaazonosítási céllal. Quarta és mts. (1998) RFLP és RAPD markerekkel végzett vizsgálata ad magyarázatot erre. Munkájukban 37 mandula, ıszibarack fajta genetikai diverzitását jellemezték. A felhasznált 28 próba közül csak kilenc adott polimorf mintázatot, amely jól demonstrálja, hogy az RFLP markerek korlátozott mértékben használhatók fel fajtaazonosítási célokra. Talán az egyedüli kísérletet, amely eredményesnek tekinthetı De Vicente és mts. (1998) végezték, mely során 52 európai és észak-amerikai kajszifajtát hasonlítottak össze RFLP markerekkel. A 33 genomi és cDNS próba közül 18 bizonyult polimorfnak. Az általuk kimutatott polimorfizmus (48 értékelhetı sáv) elegendı volt a 45 genotípus azonosítására.
15
Az RFLP-, RAPD- és AFLP-technikákkal kimutatható genetikai variabilitás fokát elıször 16 kajszifajtában Hurtado és mts. (2001) hasonlították össze. Noha az összes markertípus alkalmas volt a fajták megkülönböztetésére és a származásuk szerinti csoportosításra, az AFLP szolgáltatta messze a legtöbb polimorf markert. Az egy primerre esı polimorf markerek számával kifejezett hatékonyságot figyelembe véve még a RAPD-módszer is kétszer hatékonyabbnak bizonyult az RFLP-vel való összehasonlításban. A fentiek alapján elmondható, hogy a Prunus nemzetségben a térképezésen kívül az RFLP-markerek használata erısen korlátozott. Mindamellett, hogy megjelentek már jóval nagyobb polimorfizmust adó technikák, az RFLP idı és költségigényes, valamint az izotóp használata miatt veszélyes is. Nem beszélve arról, hogy alkalmazásához jelentıs mennyiségő, jó minıségő DNS szükséges. Manapság a térképezési céloknál is egyre nagyobb szerep jut az AFLP- és a mikroszatellit markereknek, illetve az RFLP módosított változatának a PCR-RFLP-nek vagy más néven CAPS-nak.
16
2.5
PCR – polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) A legenda szerint a PCR elve 1983 áprilisában Kary Banks Mullis elméjében
született meg. A módszer elvét egy gyakorlati eredmény bemutatásán keresztül 1985ben közölték (Saiki és mts., 1985). Ettıl az idıponttól egy egyszerő elven alapuló, de zseniális technikával bıvült a molekuláris biológia eszköztára. A ciklikus, enzimkatalizált, DNS-szintetizáló eljárás lehetıséget teremtett arra, hogy kimutatható szintre növeljék a vizsgálni kívánt DNS-szakaszt, lényegében megszüntetve a DNSvizsgálatok mennyiségi korlátait. A technikával specifikus szekvenciájú oligonukleotid primerek által közrefogott DNS-szakaszokat lehet enzimatikus módon felszaporítani (Mullis és Faloona, 1987). A PCR reakció a DNS-függı polimerázok aktivitásán alapul. Ezek az enzimek egy indító oligonukleotid, a primer segítségével képesek lemásolni, és így megkettızni az eredeti DNS-szálat. Ismételt mőködésük során a templát szakasz hatványozottan felsokszorozódik (Innis és mts., 1990). Akár 10000 bp hosszú DNSszakasz is amplifikálható ezzel a módszerrel. A PCR módszer széles körő elterjedését egy termostabil DNS-polimeráz (Taq polimeráz) alkalmazása, valamint az automatizált főtıblokk (PCR készülék, thermocycler) kialakítása tette lehetıvé. Korábban a PCR-hez az E. coliból származó Klenow enzimet használták. Ekkor azonban a magas hımérsékleten nemcsak a DNS, hanem az enzim is denaturálódott, ami azt jelentette, hogy a hıérzékeny polimeráz enzimeket minden ciklus után újra a reakció elegybe kellett adagolni. Az amerikai Yellowstone Nemzeti Park forró viző hıforrásában fedezték fel a Thermus acqaticus baktériumot (Brock és Freeze, 1969), amely 94 ºC-on él, és a belıle kinyert DNS-polimeráz ezen a hımérsékleten is megırzi aktivitását. A PCR reakció ciklusokból áll, egy cikluson belül pedig három fı lépés követi egymást. •
Kettısszálú DNS denaturálása hıkezeléssel (92-95 ºC)
•
A target DNS-szakasszal komplementer két oligonukleotid hibridizálása az egyes DNS-szálakhoz. A kapcsolat stabilizálásához a reakciómixet le kell hőteni, és az oligonukleotidokat nagy feleslegben kell alkalmazni. Az ideális hımérsékletet az alkalmazott primerek hossza és bázisösszetétele határozza meg.
•
Új DNS-szálak szintézise dNTP-k és DNS-polimeráz segítségével (72 ºC) Harminc-negyven ciklus alatt a reakcióelegyben lévı, akár pikogrammnyi DNS-
bıl mikrogrammnyi mennyiséget lehet elıállítani. Az PCR reakciót a primer
17
kapcsolódási és a lánchosszabbítási hımérséklet változtatásával módosíthatjuk. A ciklusszám növelésével pedig a célszekvenciákhoz közelítı, egyre rövidebb fragmentumokat kapunk túlsúlyban.
2.6
RAPD-polimorfizmus A RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) módszer a genomi DNS egyes
szakaszainak felszaporításán alapszik. A technika kidolgozásához szükséges volt a Mullis és Faloona (1987) által kidolgozott PCR eljárásra. A RAPD módszert elsıként Williams és mts. (1990) valamint Welsh és McClelland (1990) publikálták. A vizsgálataik igazolták, hogy a 8-10 nukleotidból álló primerek növények és állatok széles körénél képesek amplifikációs termék létrehozására. A primerek elıállításához nem szükséges semmilyen elızetes információ a templát DNS-rıl, szintézisük véletlenszerően zajlik. A RAPD markerek használata gyorsan elterjedt, mivel gyors, olcsó módszer és az élılények széles körénél alkalmazható a genetikai információk győjtésére. Az amplifikált DNS méretbeli különbségeit a primerek kötıhelyein, vagy a köztük lévı szakaszon bekövetkezett deléciók vagy inszerciók okozzák. Elıfordulhat, hogy a primerek kötıhelyein található nukleotid szekvenciák megváltozása okoz polimorfizmust. Ez azonban nem minden esetben igaz, hiszen a primerek kötıdéséhez nem szükséges a templát DNS és a primer teljes komplementaritása. A módszer használható genetikai variabilitás térképezésében (Arnold és mts., 1991; Welsh és mts., 1991), különféle taxonómiai célokra (Echt és mts., 1992), és genomspecifikus markerek földerítésére (Quiros és mts., 1991). A módszer kétségtelen elınye az RFLP-vel szemben, hogy a reakcióhoz nagyon csekély mennyiségő DNS szükséges (Phillips, 1994). Számtalan pozitív tulajdonsága ellenére a RAPD markerek hátránya az, hogy domináns öröklıdésőek. A hasadó utódnemzedékben csak a RAPD markerek jelenléte vagy hiánya mutatható ki, ezáltal a heterozigóta egyedeket nem lehet elkülöníteni a homozigóta egyedektıl (Phillips, 1994). A módszer másik negatívuma az, hogy a kapott eredményeket nehéz reprodukálni. A megismételhetıséget fıleg a templát DNS minısége és mennyisége befolyásolja. A RAPD mintázatokban lévı, az ismételt reakciók során tapasztalt eltéréseket leginkább a DNS etanollal kicsapható
18
szennyezıdései okozzák. A nagyon kicsi vagy nagyon nagy templát DNS koncentráció szintén megbízhatatlan mintázathoz vezet. Néhány primer-templát kombináció nem ad reprodukálható
mintázatot.
Ezen
a
reakció
paramétereinek
(pl.
magnézium
koncentráció) megváltoztatásával lehet javítani (Hajósné, 1999). A gyorsaságának és hatékonyságának köszönhetıen viszont több növénynél felhasználták ezt a technikát a térképezésben. A RAPD-markerek felhasználásával készültek például a lucerna (Kiss és mts., 1993), lóbab (Torres és mts., 1993), alma (Hemmat és mts., 1994), cseresznye (Stockinger és mts., 1996) kapcsoltsági térképek. Hasadó nemzedékek RAPD módszerrel
történı
elemzése
számos
esetben
sikeres
volt,
például
a
rezisztenciagénekhez kapcsolt markerek azonosítása paradicsomnál (Martin és mts., 1991), napraforgónál (Lawson és mts., 1996), búzánál (Hu és mts., 1997), salátánál, (Paran és mts., 1991) valamint babnál (Adam-Blondon és mts., 1994) történt.
2.6.1 RAPD-polimorfizmus kimutatása a Prunus nemzetségben 2.6.1.1 İszibarack A többi növényfajhoz hasonlóan a PCR alapú markerek közül a RAPD módszert alkalmazták elıször a csonthéjas gyümölcsfajoknál is. Elıször a csoportban gazdaságilag legfontosabb növényfajnál, az ıszibaracknál kezdıdtek meg a vizsgálatok. A legelsı vizsgálatokat, melyben RAPD markereket is használtak, Rajapaske és mts. (1996) végezték. Kapcsoltsági térképet készítettek RFLP, RAPD és morfológiai markerekkel. A hasadó F2 nemzedékben összesen 65 markert sikerült azonosítaniuk, 46 RFLP, 12 RAPD, valamint 7 morfológiai lókuszt. Az azonosított markerek nyolc kapcsoltsági csoportban 333 cM távolságot fedtek le az ıszibarack genomban. A markerek közti átlagos távolság 8 cM volt. Az elsı fajta-összehasonlító vizsgálatokat Warburton és Bliss (1996) végezték, amikor 136 különbözı földrajzi területrıl származó ıszibarack fajtát hasonlítottak össze RAPD-dal. Sikerült 12 jól elkülönülı csoportba sorolniuk a fajtákat. A csoportok közül kilenc az ázsiai fajtákat tartalmazza, míg az európai és amerikai fajták három csoportot alkottak, és kisebb változatosságot mutattak. Lu és mts. (1996) tizennyolc ıszibarackalanyfajta között tudtak különbséget tenni a RAPD technikával, és olyan genetikai hasonlóságot kaptak, amely megfelel az eredetüknek. A dendrogramon található elsı elágazódás alapján a fajtákat gyökérfonálféreggel szembeni ellenállóságuk, illetve
19
fogékonyságuk szerint lehetett csoportosítani. Hashmi és mts. (1997) által végzett vizsgálat bizonyította a RAPD markerek alkalmasságát az ıszibarack szomaklonális variánsok kimutatásában. Emellett igazolta, hogy valóban léteznek genetikai különbségek a variánsok között. Casas és mts. (1999) negyvenegy Prunus alanyt, különbözı fajokat és interspecifikus hibrideket vizsgáltak RAPD-dal, és a kísérletekbıl nyert eredmények alapján három olyan nagy csoportba sorolták ıket, amelyek egybe estek a már korábban morfológiai markerekkel meghatározott besorolással. A vizsgálatok megerısítették további néhány interspecifikus anyagnak az állítólagos eredetét, valamint rávilágítottak egy mirobalán klón hibás rendszertani besorolására.
6.1.1.2 Mandula Elıször mandulánál, (Prunus dulcis L.) kaliforniai fajtákon történtek RAPD markeres vizsgálatok. Bartolozzi és mts. (1998) tizenhét mandulafajta genetikai rokonságát és lehetséges eredetét vizsgálták 20 RAPD primer alkalmazásával. A rügymutánsoktól eltekintve minden egyes fajtát el tudták különíteni egymástól. A fajtákat három csoportba sorolták származásuk alapján. Resta és mts. (1998) 17 mandulafajtát hasonlítottak össze RAPD markerekkel. A felhasznált 60 primer 241 polimorf fragmentumot eredményezett. A markerekkel sikerült elkülöníteni a fajtákat, illetve a fajták közötti kapcsolatot a klaszter analízissel becsülték. Két fajta-pár között nagy hasonlóságot találtak, amely megfelelt az elızetes megfigyeléseknek.
6.1.1.3 Szilva Ortiz
és
mts.
(1997)
a
RAPD
markerek
rendkívül
nagymértékő
polimorfizmusának köszönhetıen különbséget tudtak tenni eltérı földrajzi helyekrıl származó huszonnyolc hexaploid és három diploid szilvafajta között, mindössze három primer használatával. Az amplifikált fragmentumok tisztán elváltak a diploid és hexaploid genotípusoknál, és jól korreláltak az ismert szülıikkel. Shimada és mts. (1999) negyvenkét különbözı ploidszintő szilvafajta között tudtak különbséget tenni 20 RAPD primer alkalmazásával. A vizsgálat eredményeként két fıcsoportba (európai és japán) sorolták a fajtákat. A két csoport azonban nem vált el élesen egymástól, hanem vélhetıen a keresztezıdéseknek köszönhetıen átfedéseket lehetett tapasztalni. Boonprakob és mts. (2001) a termesztett diploid szilvákat és ıseiket elemezték RAPD
20
markerekkel. A délkeleti fajtakör jóval nagyobb változékonyságot mutatott a Floridában, Kaliforniában és Dél-Afrikában termesztett fajtáknál. Nem fajtaazonosítási célokra, hanem gyökérfonálféreggel szembeni rezisztencia kimutatására használtak RAPD markereket myrobalan szilván Lecouls és mts. (1999).
6.1.1.4 Cseresznye RAPD markereket az ıszibarackhoz hasonlóan a cseresznyénél is genetikai kapcsoltsági térkép készítése során használtak fel. Stockinger és mts. (1996) 88 RAPD markerekkel 10 kapcsoltsági csoportot alakítottak ki, lefedve 503 cM távolságot a cseresznyegenomban.
Gerlach
és
Stösser
(1997)
tizennyolc
fajtát
jellemzett
molekulárisan RAPD markerekkel. A vizsgált fajták közül tizenhatot el tudtak különíteni 23 RAPD primerrel, de mint ahogyan az várható volt, a rügymutánsok között nem találtak különbséget. Elemezve a RAPD markerek felhasználásával járó kutatásokat, megállapítható, hogy az eljárás kifejlesztését követı 10 év során számos publikáció látott napvilágot, és a technikát széleskörően alkalmazták genetikai azonosításra a mezıgazdaságilag legfontosabb Prunus fajokon. Noha a RAPD markerekkel végzett kutatások a 2000. évet követıen látványosan visszaestek, napjainkban is fel-felbukkan a technika egy-egy vizsgálat erejéig. A korábbi évek tapasztalataira építve és a módszer korlátait megismerve, ma leginkább kis egyedszámú fajtacsoportok, valamint egyes kapcsolt tulajdonságok jellemzésére használják elsısorban. Ezekben az esetekben, mint az alábbi példák is mutatják, a RAPD markerek olcsó, gyors és a célnak megfelelı megoldást jelentenek. A kapcsoltsági térképek készítésére, illetve nagymérető populációk egyedeinek összehasonlítására ma már inkább jóval megbízhatóbb markereket (SSR, AFLP) alkalmaznak. Raddova és mts. (2003) a cseh nemzeti fajtagyőjteménybıl 28 ıszibarack- és két mandulafajtát vizsgáltak. A 46 vizsgált primer közül 34 produkált polimorf mintázatot, melyek alkalmasak voltak a vizsgált genotípusok egyedi azonosítására. 12 primert használtak fel dendrogram készítéséhez. Az elvégzett klaszteranalízis élesen elkülönítette a két mandulafajtát. A három további jól elváló csoportot a mandula × ıszibarack, a P. persica × P. davidiana hibridek, valamint P. persica fajták alkották. A felosztás megfelelt a rendszertani egységeknek és a fajták származásával kapcsolatos
21
elérhetı információknak, valamit a fajtaleírásoknak. Lisek és mts. (2006) a 19 legnépszerőbb lengyel cseresznyefajtát hasonlították össze RAPD markerekkel. A vizsgált 55 primer közül 26 bizonyult polimorfnak. Mindösszesen 6 primer elegendı volt a 19 fajta megkülönböztetésére az amplifikált tizenhét polimorf fragmentum alapján. A vizsgálat bizonyította, hogy kis fajtaszám és megfelelıen polimorf RAPD markerek alkalmasak fajták egyértelmő azonosítására. Jun és mts. (2002a) RAPD markereket alkalmaztak az ıszibarack fajták gyümölcshús magvaválóságának jellemzésére. A magvaválóságot egyetlen gén okozza. A magvaváló tulajdonság domináns a duránci típussal szemben. Hasadó nemzedék RAPD markeres analízisével a gén közelében 1.1 és 2.2 cM távolságra elhelyezkedı két RAPD markert találtak. A kapcsolt domináns szekvenciákból SCAR markereket terveztek, amelyek alkalmasak voltak a hasadó nemzedék, valamint a kereskedelmi fajták magvaválóságának azonosítására. Ez egyben kiváló eszköz a nemesítık számára a korai szelekcióhoz.
2.6.1.5 RAPD-polimorfizmus vizsgálata kajszibaracknál Az izoenzim vizsgálatokhoz hasonlóan kajszinál is elsıként Gogorcena és Parfitt (1994) alkalmazták ezt a technikát. Az elsı vizsgálat tulajdonképpen még csak arra szorítkozott,
hogy
a
technika
mennyiben
alkalmas
polimorf
fragmentumok
létrehozására kajsziban. Az eredmények reprodukálhatósága érdekében tökéletesíteni kellett a reakciókörülményeket, így meg kellett találni a megfelelı DNS-kivonási eljárást, az ideális DNS koncentrációt, amely az egyik kulcskérdésnek bizonyult. A kipróbált 15 primer közül 7 konzisztens és polimorf mintázatot eredményezett, így alkalmasnak bizonyult a kajszigenom jellemzésére. A szerzık azonban óvatosságra intettek a RAPD markerek megbízhatóságát illetıen, hiszen az eredményeket számos faktor befolyásolhatja. A módszert megalapozó vizsgálatokat követıen még ugyanebben az évben Shimada és mts. (1994) 54 japánkajszifajta (P. mume Sieb. Et Zucc) genetikai rokonságát vizsgálták 95 RAPD primerrel. A kapott eredmények alapján a fajtákat hét jól elkülönült csoportba lehetett sorolni, amelyek megfeleltek az eredetüknek. A vizsgálatok emellett megerısítették néhány fajta elızetesen feltételezett származási viszonyait. Ozaki és mts. (1995) ugyancsak japánkajszi fajtáknál alkalmaztak RAPD markereket a származási viszonyok tisztázására és a szülık
22
azonosítására. A polimorf DNS-fragmentumok egyértelmően azonosították a szülıket, illetve majdnem az összes hasadást mutatott az F2 utódnemzedékben. Southern blot vizsgálattal sikerült igazolni, hogy a szülıspecifikus fragmentumok átörökítıdtek az utódnemzedékbe, ezáltal a morfológiailag azonos utódok elkülöníthetık voltak egymástól. Késıbb Takeda és mts. (1998) harminchárom kajszi és két rokon faj (P. sibirica L., P. brigantina Vill.) kapcsolatát vizsgálták. Elsı körben 225 primert tesztelt le öt fajtán, melybıl mindösszesen 18 adott kellıen polimorf mintázatot. A kiválasztott primerekkel két fı csoportba sikerült sorolni a fajtákat: egy kínai eredető (Kelet-Kína és Japán) valamint egy nyugati eredető (Európa, Közép-Ázsia és Nyugat Kína) fajtakörre. Zhebentyayeva és Sivolap (2000) az addig megjelent egyik legátfogóbb vizsgálatot tették közzé. Kísérletükben RAPD és izoenzim polimorfizmust vizsgáltak a kajszi genetikai diverzitásának felmérése céljából. A nyolcvannégy jellemzett fajta az európai, iráni-kaukázusi, kínai, közép-ázsiai fajtakörbıl került ki, valamint néhány hibrid, illetve vad típust is bevontak. A különbözı eredető, és ezen belül a géncentrumokból származó fajták vizsgálatával megállapították, hogy a termesztett kajszi a vad P. armenicaból alakult ki. Ugyanakkor a kajszihoz közel álló, elsıdlegesen a kínai centrumban található fajok is szerepet játszhattak a faj háziasításában. Azt is megállapították, hogy az európai fajták genetikai diverzitása kicsi. Az ezredforduló elejétıl a kajszinál a többi Prunus fajhoz hasonlóan a RAPD markereket egyre inkább felváltották a mikroszatellit markerek, illetve párhuzamos vizsgálatokkal tették az eredményeket megbízhatóbbá. A RAPD markerek sem tőntek el teljesen, továbbra is használták kis egyedszámú csoportok azonosítására, illetve egyéb speciális célokra. Hormaza (2001) ötven különbözı eredető kajszifajtát elemzett RAPD és SSR markerekkel. A vizsgálatot kiegészítette olyan spanyol fajták tesztelésével, amelyek pomológiai jellemzık alapján nagyon közel álltak egymáshoz. A két markerezési technika kombinációja lehetıvé tette a valóban különbözı genotípusok azonosítását és a szinonim fajták kiemelését. Hurtado és mts. (2001) tizennyolc, Spanyolországban termesztett kajszifajtát jellemeztek RAPD markerekkel. Negyven dekamer primert próbáltak ki, melybıl huszonkettı 45 könnyen reprodukálható, markerként használható fragmentumot eredményezett. A 18 fajta mindegyike megkülönböztethetı volt ezzel a néhány primerrel. UPGMA klaszter analízissel a fajtákat 5 csoportra lehetett osztani.
23
Megállapították, hogy a RAPD markerek eszközei lehetnek a genetikai diverzitás jellemzésének, a genotípusok közti hasonlóság kimutatásának, új genotípusok azonosításának, ezáltal értékesek a kajszi nemesítésében. A módszer emellett alkalmas kereskedelmi tételek azonosítására rutinszerő, olcsó és gyors eljárással. Jun és mts. (2002b) RAPD markereket használt 31 különféle Prunus taxon genetikai kapcsolatának elemzésére. A kipróbált több mint háromszáz primer közül 30 eredményezett fajspecifikus markereket a Prunus fajok többségénel. Érdekes, hogy P. salicina fajnál és az interspecifikus Plumcot hibridnél nem találtak specifikus RAPD markereket. A 31 Prunus taxont három nagy csoportra lehetett osztani a markerekkel, amely összhangban van az érvényben lévı osztályozási rendszerrel. Mariniello és mts. (2002) RAPD markerekkel azonosított 19 olasz, görög és észak-amerikai fajtát. Meghatározta az amplifikált régiók pontos szekvenciáját, és ennek alapján SCAR markereket tervezett. Pedryc és mts. (2002) Magyaroszágon termesztett tizennégy fı fajtát, valamint további három világfajtát jellemzett RAPD markerekkel. A kipróbált hatvan primer közül 45 esetben sikerült jól detektálható fragmentumokat elérni. A kapott fragmentumok többsége uniformnak bizonyult, azonban nyolc polimorf mintázatot mutatott. Az eltérı fragmentumokat felhasználva sikerült két fajtapár kivételével az összes fajtáról egyedi DNS ujjlenyomatot készíteni. Mivel az egyik esetben két klónról, míg a másik esetben gyaníthatóan ugyanarról a fajtáról volt szó, a vizsgálat tulajdonképpen megerısítette azt az elızetes feltételezést, hogy a két fajtapár genetikai háttere azonos. A vizsgálatot azonos növényanyagon a késıbbiekben mikroszatellit markerek használatával Ruthner és mts. (2003) megerısítették. Baránek és mts. (2006) 15 genotípust vizsgált a Prunus nemzetségbıl RAPD és SSR markerekkel. Összehasonlították a mikroszatellit és RAPD markerek által produkált polimorfizmust, és kapcsolatukat a klasszikus morfológiai alapokon nyugvó fajtaleírással. Érdekes módon a RAPD által elért eredmény jobban igazolta az elméleti várakozásokat, amely irányadó lehet a késıbbi vizsgálatokhoz.
24
2.7
Az AFLP markerek A genomi DNS restrikciós emésztésén és a fragmentumok szelektív PCR
amplifikációján alapuló módszer (Vos és mts., 1995). Az AFLP eljárás az RFLP-hez hasonlóan elsı lépésben restrikciós endonukleázokkal – egy ritka és egy gyakori felismerési szekvenciával rendelkezı enzimmel – emészti a DNS-mintát. Következı lépésként történik a duplaszálú DNS-adapterek ligálása a fragmentumok végére, és ezt követi az adapterekre és a hasítóhelyre tervezett primerek közötti DNS-szakasz amplifikálása, majd gélen való megjelenítése. Az AFLP mintázatot a restrikciós fragmentumok hosszában megnyilvánuló különbség eredményezi, amelyet inszerció, deléció, pontmutáció okozhat, amelyek restrikciós helyeket hoznak létre vagy szüntetnek meg. Az AFLP módszer kulcsa a szelektív amplifikációban alkalmazott primerek kombinációja. Az AFLP számos elınnyel rendelkezi a RAPD technikához képest, mivel nagy a teljesítıképessége, sok fragmentumot eredményez, a primerek kapcsolódásának nagyfokú specifikussága pedig biztosítja a reprodukálhatóságot. Bármely szervezetre, fajra alkalmazható elızetes térképezés, illetve markerfejlesztés nélkül is.
2.7.1 AFLP markerek alkalmazása a Prunus fajoknál Amíg az RFLP módszert elsısorban a térképezési célokra használták a génuszban, addig az AFLP-t elsıdlegesen a fajtaazonosítás, a genetikai távolságok és a származási kérdések tisztázása érdekében alkalmazták. Az AFLP fajtaazonosítási célokra történı alkalmasságát elsıként Dirlewanger és mts. (1998) bizonyították. Megerısítették azt a feltételezést, hogy az ıszibarack polimorfizmusának kutatásánál az AFLP technika jóval hatékonyabb, mint akár a RAPD vagy az RFLP. Az AFLP a nemzetségen belül az öntermékenyülı ıszibarackban jutott jelentısebb szerephez, hiszen ez a szaporodási mód nagymértékben csökkentette a termesztett fajtákban a genetikai változékonyságot. Munkájukban hatvanhat fajtát jellemztek RAPD és AFLP markekkel. Kiemelték, hogy ugyan a két módszer együttes alkalmazása kiegészíti egymást, mégis az AFLP összességében hatékonyabbnak bizonyult. Aranzana és mts. (2001a) az idıközben elérhetıvé vált mikroszatellit markereket hasonlították össze az AFLP–vel, amikor 100 ıszibarack fajtát hasonlítottak össze. A felhasznált 40 AFLP marker 97 genotípust azonosított, míg a 7 SSR marker „csak” 78
25
fajtát tudott megkülönböztetni egymástól. A két módszer kombinációja azonban már 99%-os eredményt hozott. A módszer alkalmasságát megalapozó vizsgálatokat követıen „futószalagon” érkeztek a nemzetségen belüli fajtaazonosítást és származási viszonyokat célzó vizsgálatok. İszibarackban Shimada és mts. (1999) különítettek el 8 nagyon hasonló származású fajtát AFLP-vel. Ezt követıen Aranzana és mts. (2003a) 210 fajtát 9 AFLP primer kombinációt felhasználva elemeztek. A fajták 93%-át sikerült elkülöníteni a módszerrel. A nagyfokú polimorfizmust talán még jobban jellemzi, hogy 187 fajtát már mindössze három primer segítségével el lehetett különíteni egymástól. Cseresznyében elıször Boritzki és mts. (2000) 10 AFLP primerpár használatával 128 cseresznyefajta azonosítását végezték el. Összesen 712 AFLP fragmentumot nyertek, amelyek közül 124 bizonyult polimorfnak. Majd Tavaud és mts. (2001) a francia termesztett cseresznyefajták és a vad P. avium L. genotípusok variabilitását vizsgálta. A 4 primer felhasználásával nyert 76 marker klaszteranalízise a termesztett fajtákat 3 csoportba sorolta. A vad genotípusok külcsoportot alkottak. A dendrogram elemzése alapján a szerzık feltételezték, hogy a francia vadcseresznye legalább két eltérı származási ágon alakult ki. Ugyanezt meg lehetett állapítani a termesztett fajtákról is. Hasonló fajtaazonosítási célú vizsgálatokat végeztek cseresznyében még Struss és mts. (2001), valamit Zhou és mts. (2002). A cseresznyénél és meggynél kulcskérdés a ploidfok, valamint a különbözı interspecifikus hibridek genetikai származásának ellenırzése. Tavaud és mts. (2004) AFLP-markerekkel elemezték a P. avium L. (AA 2n=2x=16) és P. cerasus L. (AAFF 2n=4x=32) fajokat. A P. cerasus F genomja a P. fruticosa-ból származik. Nagy valószínőséggel sikerült azonosítani azt az AFLP markert, amely alkalmas az A és F genom azonosítására és nyomon követésére az egyéb interspecifikus hibridekben is. Goulao és mts. (2001) AFLP markereket használtak a diploid, és a hexaploid szilvák elkülönítése céljából. Bianchi Valmor és mts. (2002) az AFLP mellett SSRmarkereket használták a dél-brazíliai szilvák jellemzésére. A szerkesztett dendrogramon a hexaploid szilvák élesen elkülönültek a diploidoktól. Martins és mts. (2001) harmincöt portugál mandulafajtát vizsgált meg nemesítési programjának elıkészítése során. Yon és RongCai (2004) 5 rokonfajba tartozó 49
26
egzotikus és helyi mandulafajtát jellemzett 3 AFLP primerrel. A mandulafajták egy csoportba kerültek a klaszteranalízis során, bár nagy polimorfizmust mutattak. Az AFLP-vel végzett mandulamarkerezési tanulmányok közül kiemelkedik Sorkheh és mts. (2007) munkája. Ebben mintegy 45 iráni, európai és amerikai fajtát vizsgáltak 19 primerkombinációval. Sikeres volt a vizsgált genotípusok egyedi azonosítása. A közölt eredményekbıl jól látható, hogy a markerekkel kimutatott polimorfizmus tökéletesen alkalmas volt a fajták földrajzi eredetének bizonyítására, de csak kis korrelációt mutatott az agronómiai tulajdonságok alapján szerkesztett csoportokkal. A kajszinál elsıként Hurtado és mts. (2002a) 16 fajtát vizsgáltak 6 primerpárral. Eredményként 231 polimorf markert sikerült azonosítani, amelyek minden egyes fajtának egyedi mintázatot biztosítottak. Hasonló céllal Hagen és mts. (2002) 47 különbözı eredető fajta AFLP polimorfizmusát vizsgálták 5 primerkombinációval. A kísérletbe vont eltérı származású genotípusok kellıen széles spektrumot biztosítottak a módszer tesztelésére, és az általánosítható következtetések levonására. Összesen 379 polimorf marker elemzésével megállapították, hogy a fajták eredetének függvényében a kajszi genetikai diverzitása folyamatosan csökken Közép-Ázsia és Dél-Európa között. Az eredmények közvetlenül felhasználhatók a nemesítési alapanyagok kiválogatásakor. Az AFLP használata egyre népszerőbbé vált a kajszinál is, és újabb fajtaköröket vontak be a kutatásokba. Panaud és mts. (2002) a Szahara oázisaiban termesztett 19 fajtát jellemzett AFLP markerekkel. Ebben a kísérletben 7 primer 97 polimorf markert eredményezett. Ez a variabilitás elegendı volt az összes fajta egyedi azonosítására. Az AFLP ilyen célú felhasználásra való alkalmasságát Ricciardi és mts. (2002) is megerısítették a dél-olasz apuliai genotípusok azonosításával. A kutatási célú fajtaazonosítás és a származási viszonyok meghatározása mellett a szakirodalomban találni forrást az AFLP markerek egyéb célú felhasználására a Prunus nemzetségben. Az AFLP MAS-ban való felhasználhatóságára példa Wu és mts. (2004) vizsgálata, amelynek során sikerült megtalálniuk azt az AFLP markert, amellyel az ıszibarackban szelektálni lehet a nagy és kis savtartalmú genotípusokat. Az elsı ıszibarackalanyokat elemzı genetikai térkép is AFLP markerek felhasználásával készült el (Lu és mts., 1998). A térképen olyan markerek is szerepelnek, amelyekkel a nematóda rezisztencia nyomonkövetése válik lehetıvé. Térképezési célokra használták az AFLP technikát Dirlewanger és mts. (1998) is, amikor izoenzim, RFLP, RAPD és
27
SSR markerek mellett 115 AFLP markert helyeztek el az ıszibarack kapcsoltsági térképén. A vizsgálat eredményeként 11 kapcsoltsági csoportban 714 cM távolságot fedtek le, és markerenként 4,5 cM átlagos távolság adódott. Gyakorlatorientált fajtaazonosítási célokra dolgoztak ki technikát Struss és mts. (2003). A módszer annyiban tér el a korábban megismertektıl, hogy olyan DNSkivonási eljárást sikerült kidolgozniuk, amely által a gyümölcshúsból is képesek voltak az AFLP-hez megfelelı DNS-t izolálni. Így lehetıvé vált a frisspiaci meggytételek fajtaazonosítási célú vizsgálata. Ez mindenféleképpen jelentıs eredmény, hiszen a jó minıségő DNS alapfeltétele az AFLP vizsgálatoknak. Ennek érdekében dolgoztak ki külön AFLP célú DNS-kivonási eljárást ıszibarackban Manubens és mts. (1999). A DNS-minta jelentıségét Aranzana és mts. (2001b) is kiemelték. Levélbıl és gyümölcsbıl nyert DNS-t alkalmazva nekik nem minden esetben sikerült azonos AFLP mintázatot nyerniük. Ahogyan a fenti összefoglaló is mutatja, az AFLP markereket elıszeretettel használták a Prunus nemzetségben, elsısorban fajtaazonosítási célból, valamint származás és diverzitás kutatására. Ennek ellenére visszaszorulóban van a használata, amelyet részben a módszer relatív bonyolultsága és költségessége indokol. Az AFLP markerek a korábbinál ritkább használatának másik indoka a könnyebben kezelhetı mikroszatellitek megjelenése volt (Wünsch és Hormaza, 2002a).
2.8
Mikroszatellit markerek
2.8.1 A mikroszatellit markerek jellemzıi, funkciója és evolúciója A mikroszatellitek (Litt és Luty, 1989) abba a repetitív szekvencia családba tartoznak, amelyben igen egyszerő di-, tri- tetra-, vagy pentanukleotidok egymást követve ismétlıdnek egy szakaszon. A mikroszatelliteknek többféle szinonim megnevezését is ismerjük, amelyek a következık: VNDR (Variable Number of Dinucleotide Repeats - változó számú dinukleotid ismétlıdések, Nakamura és mts., 1987), STR (Short Tandem Repeat - rövid tandem ismétlıdés, Edwards és mts., 1991), SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism – egyszerő szekvencia hosszpolimorfizmus), ETR (Exact Tandem Repeats – precíz egymást követı ismétlıdések) vagy SSR (Simple Sequence Repeat - egyszerő szekvencia ismétlıdés, Jacob és mts., 1991).
28
A szatellit szekvencia kifejezést már jóval korábban alkalmazták annál, mint hogy tudták volna a jelenség DNS-szintő hátterét. Az eukarióta DNS ultracentrifugában kialakított sőrőség gradiens hatására a vizsgált DNS átlagát reprezentáló széles csúcs mellett, számos kisebb csúcs jelent meg. Az eltérı sőrőséget jelzı szokatlan kis csúcsokat szatellit csúcsoknak, a kialakulásukat eredményezı DNS-régiókat pedig szatellit DNS-nek nevezték el. A renaturáció kinetikai elemzése vezetett ahhoz a felismeréshez, hogy a szatellit DNS akár több millió repetitív szekvenciát tartalmazhat. A repetitív szekvenciák kutatásában igazi áttörést Tautz és Renz (1984) kísérletsorozata jelentett. Az eredményeik azt bizonyították, hogy az ismétlıdı szekvenciák általánosan fordulnak elı az eukarióta szervezetekben, és tulajdonképpen mindenféle dinukleotid ismétlıdése lehetséges. A szerzık ekkor már feltételezték, hogy az ismétlıdéseket a replikáció során bekövetkezı csúszás (slippage) okozza. A késıbbiekben még további kísérletek és feltételezések láttak napvilágot az ismétlıdések okát illetıen. Levinson és Gutman (1987), valamint Schlötterer és mts. (1991) szerint a replikáció
során
kialakuló
frameshift
mutáció
okozza
az
ismétlıdéseket.
Megállapították, hogy a frameshift mutációk nagy gyakorisággal fordulnak elı az ismétlıdı szekvenciákat tartalmazó régiókban, azonban a rögzült mutációk gyakorisága a javítás hatékonyságán múlik. Az ismétlıdı szekvenciákról sokáig azt gondolták, hogy a génmőködésben nem játszanak különösebb szerepet. Néhány növényfaj teljes genomjának megismerése rávilágított arra, hogy a mikroszatellit szekvenciák eloszlása nem egyenletes a genomon belül (La Rota és mts., 2005). A mikroszatellitek leginkább a gének határoló régióiban, illetve géneken belül helyezkednek el (Fujimori és mts., 2003). Egyre több a bizonyíték arra, hogy a korábban funkcionálisan semlegesnek gondolt DNS-szakaszok szerepet játszanak a gének mőködésének szabályozásában (Li és mts., 2004). A mostanában, Arabidopsison és rizsen végzett kutatások azt a meglepı eredményt hozták, hogy a vizsgált mikroszatellit szekvenciák 80%-a kapcsolatban van a génekkel. A szekvenciák jelenléte és a génexpresszió együttes vizsgálata alapján feltételezhetı, hogy a mikroszatellitek a növényi gének százainak mőködését befolyásolják (Sharapova, 2008). A génregulációs szerepet a korábbi vizsgálatok elsısorban azzal magyarázzák, hogy a mikroszatellitek részt vesznek a DNS másodlagos szerkezetének kialakításában, amely hatással van a kapcsolatban lévı gének
29
transzkripciójának intenzitására (Tóth és mts., 2000). Ez a felfedezés lehetıséget biztosíthat arra is, hogy a mikroszatelliteket a jövıben ne csak a szelekciót segítı eszközként, hanem közvetlenül is felhasználják a nemesítési programokban a genetikai szabályzás befolyásolásával. Az elızıekben tárgyalt mechanizmusok, mint például a frameshift mutációk már csak a meglévı variabilitást növelik. Ennek tükrében jogosan merül fel a kérdés, hogy milyen módon keletkezhettek ezek az ismétlıdések. Jelenleg az az általános vélekedés, hogy egy véletlenszerő proto-mikroszatellitre van szükség a mikroszatellit régiók kialakulásához (Levinson és Gutman, 1987). Sokáig ismeretlen volt, hogy létezik-e olyan minimális ismétlıdésszám, amelynél már a DNS-polimeráz megcsúszására nagy valószínőséggel sor kerül. Elıször Pupko és Graur (1999) élesztınél bizonyították, hogy már két ismétlıdésbıl álló repetitív szekvencia is kiválthatja a DNS-polimeráz megcsúszását. A mikroszatellitek kialakulása mellett másik érdekes kérdés, hogy milyen módon alakul ki ezen régiók hossza, azaz létezik-e olyan optimális mérettartomány, ami az evolúció során képes volt fennmaradni. A szabálytalan replikáció növelheti, illetve csökkentheti is az ismétlıdések számát. Azt, hogy mikor melyik mechanizmus alakítja a mikroszatellit régiók hosszát, elıször élesztın sikerült meghatározni. A kísérletek kimutatták, hogy a rövid és hosszú szekvenciák mutációinak eredménye más-más tendenciát mutat. Míg a rövidebb szekvenciák frameshift mutációi általában hosszabb szekvenciákat hoznak létre, a hosszabb szekvenciák rövidültek a DNS-slippage következtében (Wierdl és mts., 1997). A folyamat önmagát szabályozza, mindenféle külsı szelekciós nyomás befolyásoló hatása nélkül.
2.8.2 A mikroszatellit markerek alkalmazhatósága a növényekben A mikroszatellitek számos olyan tulajdonsággal rendelkeznek, melyek alapján alkalmasak a növényi genom markerezésére, valamint kapcsolt tulajdonságok térképezésére. Többnyire rendkívül nagy allélváltozékonyságot mutatnak a populáción belül, emellett a mikroszatellitek kodominánsak, és a lókuszok heterozigótasági indexe nagyon magas. İröklıdésük egyszerő mendeli szabályok szerint történik, így egyszerően használhatók kapcsoltsági csoportok elemzésére (Gupta és mts., 1996). Rendkívüli variabilitását több szerzı is bizonyította, ezért a növényi genomok
30
jellemzésére az egyik legalkalmasabb módszernek tekinthetık. Az eddigi vizsgálatok azt mutatták, hogy a növényekben és az állatokban található mikroszatellitek nukleotidösszetétele külünbözı. „Míg az emlıs genomra az (AC)n vagy a (AG)n, (CG)n, addig a növényekre a (TA)n, (AG/TC)n, (AC,TG)n motívumok a legjellemzıbbek. A (CG)n elıfordulása még kérdéses” (Kiss, 2005). A növényi mikroszatellit markerek egyik alapvetı tulajdonsága, hogy az ismétlıdı egységek száma tekintetében is rendkívül polimorfak úgy a fajok, mint az egyedek között egyaránt (Akkaya és mts., 1992; Saghai-Maroof és mts., 1994). Az ismétlıdı motívumsor szempontjából: perfekt, imperfekt és összetett (compound repeat) szekvenciákat különböztetünk meg (Weber, 1990). A perfekt mikroszatellitek szabályosan ismétlıdı egységekbıl épülnek fel. Az imperfekt mikroszatellitek esetén egy vagy több nukleotid ékelıdik a perfekt sorba. Az összetett szekvenciájú mikroszatelliteknél különbözı típusú ismétlıdı szekvenciákból épül fel a mikroszatellit régió. A perfekt szekvenciáknál Weber (1990) megfigyelte, hogy az ismétlıdı egységek számának növekedésével nı a lókusz információ tartalma, és több allél keletkezése várható. Ez a megállapítás azonban nem volt igaz az imperfekt szekvenciákra. Az azonos ismétlıdéső imperfekt szekvencia információtartalma lényegesen kisebb, mint a perfekt szekvenciáké.
2.9
Mikroszatellit markerek használata a Prunus nemzetségben
2.9.1 Mikroszatellit régiók azonosítása és primerfejlesztés A Prunus nemzetségben a mikroszatellit markeres kutatásokat Cipriani és mts. (1999) korszakalkotó munkája tette lehetıvé. A munkacsoport 17 primer szekvenciáját közölte, melyet a ‘Red Haven’ ıszibarackfajta genomi könyvtárából klónozott és szekvenált. Tíz mikroszatellit medeli öröklıdést is mutatott a hasadó visszakeresztezett nemzedékben. 15 primer polimorf volt a megvizsgált 10 ıszibarack genotípusnál, lókuszonként 2-4 allélt találtak. A mikroszatellit régiók határoló szekvenciájának konzervativizmusát kihasználva a kifejlesztett primereket más Prunus fajokon és almán is tesztelték. A primerek több mint a fele alkalmas volt az amplifikációra. Tíz primer hatékonyan mőködött P. domestica L., P. salicina Lindl., P. armeniaca L., P. dulcis L., P. persica var. leavis, P. avium L. és P. cerasus L. fajokban. Három primer alkalmasnak bizonyult a Malus x domestica Borkh. SSR-markerek amplifikációjára is.
31
Cipriani és munkatársainak publikációját követıen számos új eredmény született a mikroszatellitek kutatásában a Prunus nemzetségen belül. Már a következı évben ugyanaz a kutatómőhely újabb, 26 ıszibarackból kifejlesztett primert mutatott be (Testolin és mts., 2000). Ebben a közleményben már nemcsak a primerfejlesztésre koncentráltak, hanem az új lókuszok segítségével 50 ıszibarack és nektarinfajtát teszteltek. Az újonnan kifejlesztett primerek mindegyike polimorf mintázatot (2-8 allél/lókusz) eredményezett. Sikerült elkülöníteni a fajták döntı többségét, kivéve néhány, genetikailag nagyon közel álló fajtát, mint például a ‘Compact Redhaven’ és ‘Redhaven’, ahol azonosságot tapasztaltak. Emellett sor került néhány tisztázatlan eredető fajtánál a fajta származásának pontosítására, illetve több esetben sikerült megerısíteni a feltételezett szülıi vonalakat. Az egymástól független, párhuzamos kutatások tényét bizonyítja, hogy ugyanabban az évben egy amerikai kutatócsoport, Sosinski és mts. (2000) közzé tette az ıszibarack genomi és cDNS szekvenciái alapján kifejlesztett 10 primerbıl álló sorozatot. Az elızı példáktól eltérıen nem az AC/GT és AG/CT ismétlıdéső mikroszatellit régiókat azonosították, hanem a CT/GA, CA/GT valamint egy AGG/TCC poli-trinukleotidot. Ebben a kísérletben is elvégezték a fajon belüli polimorfizmus vizsgálatot 28 ıszibarack fajta bevonásával, amely lókuszonként 4 allélt eredményezett. A primerek fajok közti amplifikációs képességét is tesztelték. A primerek mőködtek kajsziban, meggyben, rózsában, sıt Arabidopsisban is. Yamamoto és mts. (2002) tovább növelték az elérhetı primerek körét, amikor újabb 36 mikroszatellit markert azonosítottak ıszibarack genomi és gyümölcs cDNS könyvtár használatával. A nagy primerfejlesztés idıszaka Dirlewanger és mts. (2002) által nyilvánosságra hozott 41 SSR primer szekvenciával zárult. A primereket 12 rokon és nem rokon (pl. dió és mogyoró) fajokon is sikerrel tesztelték. A kezdeti lépéseket követıen számos további primer fejlesztése történt a Prunus nemzetségen belül. A fejlesztések többsége ıszibarack genomi vagy cDNS könyvtárak alapján történt, de ezenkívül több primert terveztek a cseresznye, kajszi, mandula és szilva genomok alapján. A mikroszatelliteknek a nemzetségen belül több fajnál történı sikeres felhasználása általánosnak tekinthetı. Nem ritka a más nemzetségben való alkalmazás sem. A primerek tervezésének új irányát jelzi, hogy már megjelentek olyan közlemények is, amelyek a teljes Rosaceae családban megfelelıen mőködı
32
primerkészletek kifejlesztését tőzték ki a kutatás céljául (Nishitani és mts., 2007). E szerzık munkájának különlegessége, hogy a hosszú repetitív szekvenciákat (tri- és hexanukleotid) tartalmazó mikroszatellit régiókat kutatták. Az újonnan létrehozott primereket kezdetben fıleg a polimorfizmus megállapítására és a fajták elkülönítésére használták különbözı Prunus fajoknál. Manapság az új primerekkel szemben viszont már más elvárásokat támasztanak, mint például egy-egy nemesítési szempontból lényeges tulajdonság nyomonkövetése.
2.9.2 Mikroszatellit markerek alkalmazása a fontosabb Prunus fajokban 2.9.2.1 İszibarack Az elızı fejezetben ismertetettek szerint a primerfejlesztés és a markerezési munka elsıként a csoporton belül gazdaságilag legjelentısebb gyümölcsfajon, az ıszibarackon kezdıdött. Az elsı években már jelentıs mennyiségő tudás és tapasztalat, és nem utolsó sorban számos mikroszatellit régióra tervezett primer szekvencia állt rendelkezésre. Nem véletlen, hogy a meglévıket gyorsan követték további kutatások további fontos fajtakörök származási viszonyainak jellemzésére. Aranzana és mts. (2001a)
AFLP
és
SSR
markerek
alkalmazhatóságát
100
ıszibarackfajta
polimorfizmusának vizsgálatánál alkalmazta. A felhasznált 9 AFLP és 7 SSR primerkombinációval lehetséges volt a vizsgált genotípusok azonosítása. Ezzel a kutatással Olaszországot és az USA-t követıen egy újabb jelentıs ıszibaracktermesztı központ, Spanyolország is bekapcsolódott a kísérletekbe. Yu és mts. (2004) hét genetikailag közel álló Prunus faj (P. amygdalus, P. persica. subsp. ferganensis, P.persica, P. kansuensis, P. mira, P. davidiana és P. persica subsp. potanini) SSR elemzésének eredményeit közlölték. A legnagyobb mértékő azonosságot a P. persica subsp. ferganensis és P. persica között tapasztalták. Ehhez hasonló fokú rokonságot a P. persica subsp. potanini és P. kansuensis között mutattak ki. Az ıszibarackfajták szők genetikai bázisa, és a világon elterjedt hasonló fajtakörök miatt a vizsgálatok hamar kiterjedtek a tájfajtákra, valamint egy-egy körzetben termesztett populációkon belüli diverzitás vizsgálatára. Badenes és mts. (2002) Valencia környéki ıszibarack tájfajtákat vizsgáltak, és annak ellenére, hogy kevésbé változékony genotípusról volt szó, sikeresen elkülönítették a különbözı termıtájakról származó fajtákat. Ebben a kísérletben számoltak be egyébként a Prunus
33
nemzetségben elıször nemesítési szempontból fontos fajtabélyegek és SSR markerek kapcsoltságáról. Wünsch és mts. (2006) 85 helyi fajtát vizsgáltak mikroszatellit markerekkel. A fajták közel felérıl egyedi ujjlenyomat készült, illetve olyan morfológiai bélyegekkel egyezı csoportokat sikerült kialakítani, mint a hússzín vagy a gyümölcs alakja. Az eredmények hozzájárulnak a spanyol tájfajták eddiginél hatékonyabb génmegırzéséhez. Hasonló kutatásokat folytatattak Bouhadida és mts. (2007) aragóniai tájfajták jellemzésére. A sikeres próbálkozásokon felbuzdulva további kutatócsoportok csatlakoztak újabb fajtakörök bevonásával. A szicíliai tájfajtákat elemezték (Marchese és mts., 2006), majd Japánban elterjedt kínai eredető ıszibarack klónok polimorfizmusát, és azok pontos származását kutatták (Mase és mts., 2007). A fajták leírásával és származásával kapcsolatos kutatásokkal párhuzamosan hamar megjelentek a fontos agronómiai tulajdonságok nyomonkövetését célzó SSR markeres vizsgálatok. A területen úttörı munkát végeztek Yamamoto és mts. (2001), amikor mikroszatellit markerekkel 9 egyszerően öröklıdı monogénes tulajdonság (pl. hússzín, virágszín, héjszín stb.), valamint négy QTL tulajdonság (érési idı, gyümölcsméret, virágzási idı, terméselrúgás idı) kapcsoltságát vizsgálták F2 hasadó nemzedékben. Scorza és mts. (2002) kimutatták, hogy a pchgms1 jelzéső primerpár alkalmas az oszlopos növekedéső genotípusok, valamint a meghatározott színő és húskeménységő fenotípust mutató genotípusok szelektálására. Ugyanebben az évben Wang és mts. (2002) ıszibarack BAC könyvtárból AFLP technika közbeiktatásával dolgoztak ki SSR-primerkészletet, amelyeket az ıszibarackfák növekedési típusainak nyomonkövetése céljából, valamint a fonálféreg rezisztencia markerezésére terveztek. Az ıszibarack folyamatos hajtásnövekedését egy gén recesszív allélja okozza. Wang és mts. (2002) a tulajdonsághoz kapcsolt mikroszatellit markereket azonosítottak, melyek így felhasználhatóvá váltak a késıbbi nemesítési munkákhoz. Ahogyan a fenti példák is bizonyítják, a mikroszatellit markerekkel folytatott kutatások sok területen és számos kutatóhelyen indultak meg párhuzamosan. Ezt felismerve viszonylag korán, széles nemzetközi bázison megkezdıdött az ıszibarack genomikai kutatása (Abbott és mts., 2002). A konzorcium célja az ıszibarack genomját modellként használni a Rosacea család genomikai kutatására. A konzorcium munkájának legutóbbi eredményeirıl Shulaev és mts. (2008) számoltak be.
34
2.9.2.2 Cseresznye és meggy Az elsı kísérleteket 66 kései megy (Prunus serotina) genotípuson Downey és Iezzoni (2000) végezték egy meggybıl származó kloroplasztisz DNS marker, valamint 8 genomi ıszibarack, cseresznye és meggy mikroszatellit markerrel. Külön érdekesség, hogy az elsı meggyre tervezett SSR primerek egy magyar fajta, az ‘Érdi bıtermı’ genomi DNS-ének könyvtárából származnak. Ebbıl a tudományos mőhelybıl került ki a második vizsgálat is, ahol 75 különbözı származású meggyfajtát hasonlítottak össze 10 SSR primerrel. Ennek a vizsgálatnak is vannak magyar vonatkozású eredményei, hiszen sikerült megkülönböztetni az 5 ‘Pándi meggy’ klónt. A vegetatívan szaporított növények esetében nagyon jelentıs az egyes változatok pontos azonosítása biztonságos termesztésük érdekében. A fajták azonosításánál meggy esetében gyakori probléma, hogy azonos fajtákat és tájfajtákat országonként eltérıen neveznek. Erre példa a magyar ‘Pándy’ klón, ‘Crisana’ Romániában, és ‘Köröser Weichel’ Németországban (Cantini és mts., 2001). Ezt követıen a Cerasus fajok SSR-polimorfizmusát többen is leírták, és fajtaazonosításra, illetve származási viszonyok megállapítására használták (Wünsch és Hormaza, 2002b; Clarke és mts., 2004; Clarke és Tobutt, 2003; Schueler és mts., 2003; Struss és mts., 2003). E nemzetség esetében más jellegő vizsgálatot végzett Pairon és Jacquemart (2005), akik a mikroszatellitek alkalmasságát kutatták a ploidszint követésére. Az Észak-Amerikában faipari szempontból fontos tetraploid fekete cseresznyérıl nem tudni, hogy a faj allo- vagy autotetraploid. Az ellenırzött keresztezésekbıl és a vizsgált lókuszok hasadásából (két független kromoszóma szerelvény szerint) arra a következtetésre jutottak, hogy a fekete cseresznye alloploid.
2.9.2.3 Mandula Kapcsolatsági térképek készítéséhez már viszonylag hamar használtak SSR markereket. Joobeur és mts. (2000) az RFLP, RAPD és izoenzim markerek mellett, 6 mikroszatellit markert helyezett el a mandula molekuláris markerekkel szerkesztett térképén. Serrano és mts. (2002) az SSR-primerek nemzetségen belüli használhatóságát kiaknázva 25 mandulaalanyt azonosítottak ıszibarack primerekkel történt analízis alapján. Elsıként Testolin és mts. (2004) azonosítottak mandulában mikroszatellit régiókat. Összesen 44 primert terveztek, melybıl 20 amplifikációs képességét tesztelték
35
7 különbözı, a Prunus nemzetségbe tartozó fajon. A primerek 30%-a eredményesen mőködött mind a 7 taxonban, sıt kettı még az almában is lókuszokat tárt fel. A mandula genetikailag változatos és kevésbé ismert nemesítési alapanyagai sokat ígérı kutatási területet jelenthetnek. Martínez-Gómez és Gradziel (2002), valamint Sánchez-Pérez és mts. (2006a) hangsúlyozták az SSR-polimorfizmus vizsgálatának fontosságát a nemesítési alapanyagok jellemzése terén. Az alapanyagok nagy genetikai diverzitását mutatták ki a kínai munkacsoportok által közölt adatok. Ez a változékonyság jellemzı a kínai fajtákra (Xie és mts., 2006), de még inkább látványos a kínai fajták mediterrán fajtákkal való összehasonlítása, mely esetben a két régió fajtái határozottan elkülönültek a dendrogramon (Xu és mts., 2004). Ehhez hasonló nagy variabilitásról számolnak be Amirbakhtiara és mts. (2007) az iráni mandulafajták, valamint három vad faj (Prunus communis, P. orientalis és P. scoparia) elemzésekor.
2.9.2.4 Szilva A Prunus nemzetségben a többi gazdaságilag fontos fajhoz képest csak viszonylag késın közöltek szilva genomra kifejlesztett mikroszatellit primereket (Decroocq és mts., 2004). A hexaploid szilva cDNS alapján, és eddig egyedi módon kloroplasztisz cpDNS templátra terveztek mononukleotid ismétlıdéseket felszaporító primereket. Az újonnan fejlesztett primerkészlet átlagosan 6 polimorf allélt eredményezett lókuszonként, mellyel sikerült korrigálni néhány csacsaki szilvafajta feltételezett eredetét. Az elızı módszert követve Ohta és mts. (2005) diploid szilva kloroplasztisz cpDNS-ére tervezték a primerkészletüket. Tíz tervezett primer közül hét mononukleotidos ismétlıdéső szakaszokat ismert fel. Segítségükkel lehetséges volt 17 Prunus faj megkülönböztetése. A szilva mint gyümölcs taxonómiai- és így genetikai szempontból is nagyon változatos képet mutat. A faj SSR-markerekkel történı kutatásáról számoltak be Ahmad és mts. (2004), akik a diploid szilvákon kívül a pluot és plumcot hibridek, valamint kajszifajták genomját is jellemezték a mikroszatellit régiók változékonyságának vizsgálatával. A dendrogram alapján a szilvák és a ploutok élesen elkülönültek a kajszifajtáktól, míg a pluot fajták a szilva fajták között elszórtan helyezkedtek el. Ebbıl arra lehet következtetni, hogy a pluotok genetikai hátterüket tekintve közelebb állnak a szilvához, mint a kajszihoz.
36
Az amerikai szilvák bonyolult taxonómiai rendszerének molekuláris hátterébe próbáltak betekintést nyerni Rohrer és mts. (2004). Vizsgálataikból az derült ki, hogy a sokféle hibridizációra képes amerikai szilvák azonosítására nem minden esetben volt elegendı a kísérletben használt 15 SSR-primerpár, és az általuk kimutatott, lókuszonkénti átlagos 12,4 allélt eredményezı polimorfizmus. A fajtaazonosítási célú vizsgálatok mellett a szilvában is történtek egyéb célú kutatások. A gyökérfonálféreg rezisztenciát okozó génhez kapcsolt SSR markereket azonosítottak Claverie és mts. (2004).
2.9.2.5 Kajszi A kajszinál már viszonylag hamar kifejlesztésre kerültek a faj genomjára tervezett mikroszatellit primerek. A kajszi genomi DNS-könyvtára alapján Lopes és mts. (2002) 21, Messina és mts. (2004) 99 SSR lókuszt azonosított. Decroocq és mts. (2003) 10 EST SSR szekvenciát találtak a kajszi levélbıl nyert cDNS könyvtárban. A kapott primereket nemcsak kajsziban, hanem további 11 rokon és nem rokon fajban sikeresen alkalmazták. Hagen és mts. (2004) 24 primerszekvenciát írtak le. A primereket 13 genomi DNS-bıl, 8 gyümölcsbıl- 3 pedig levélbıl izolált cDNS könyvtárból azonosította. A kajszi genom alapján tervezett primerek megjelenését követıen is végeztek
azonban
kutatásokat
más,
a
Prunus
nemzetségbıl
származó
mikroszatellitekkel, így jelentısen bıvült a rendelkezésre álló primerek száma. Természetesen ennél a fajnál is már azelıtt megkezdıdtek a mikroszatellit markerekkel végzett kutatások, hogy a genomra tervezett primerek rendelkezésre álltak volna. A Prunus nemzetség más fajaihoz hasonlóan a kajszinál is a Cipriani és mts. (1999) által közzétett, ıszibarackra tervezett primerek használatával kezdıdtek el az SSR markeres vizsgálatok. Elsıként Hormaza (2002) jellemezte a kajszfajták SSRpolimorfizmusát. Negyvennyolc kajszifajtát vizsgált 37 más Prunus fajra, zömmel ıszibarackra
kidolgozott
mikroszatellit
primerekkel,
melybıl
31
megfelelı
amplifikációt biztosított. Tehát a kajszinál is megerısítést nyert, hogy a mikroszatellit régiókat határoló szekvenciák konzervatívak a nemzetségen belül. Az alkalmazott módszer hatékonyságát jól bizonyítja, hogy az összes fajtát sikerült azonosítani a 20 lókuszban megfigyelt 82 allél alapján. Külön érdekesség, hogy a ‘Gönci magyar kajszi’ is a vizsgált genotípusok között szerepelt. A kapott adatok alapján készített dendrogram
37
a fajtákat két fı csoportra osztotta. Az egyik csoport különbözı európai fajtákat, míg a másik kizárólag francia fajtákat, valamint a ‘Gönci magyar kajszit’ tartalmazta. A francia fajták és a ‘Gönci magyar kajszi’ közti hasonlóságot késıbb Ruthner és mts. (2006) is igazolták. A kajszi ázsiai géncentrumából történı terjeszkedésekor magyar kajszi fajtakör egy közbülsı állomást jelentett a nyugat-európai elterjedés során. Arra vonatkozóan pedig több szerzı is utalt már, hogy a ‘Luizet’ francia fajta pedigéjében szerepel a magyar kajszi is. Ruthner és mts. (2003) 16 Magyarországon termesztett kajszifajtát sikeresen azonosítottak 5 kajszi SSR primerrel. A vizsgálat megerısítette a korábban RAPD markerekkel közölt eredményeket ugyanennél a fajtakörnél. Regner és mts. (2004) 88 kajszi genotípust hasonlítottak össze 12 ıszibarack genomi DNS-bıl fejlesztett SSR primer segítségével. A kutatás fı célja az Ausztriában két legnagyobb területen termesztett ‘Klosterneuburger Marille’ és ‘Ungarische Beste’ fajták és klónjaik jellemzése volt. A vizsgálat azt az eredményt hozta, hogy a két fajta noha termesztési tulajdonságaiban némileg különbözı, genetikai hátterét tekintve lényegében azonosnak tekinthetı. Mindkét fajta tartalmaz azonban olyan genotípusokat, amelyek eltérnek az alaptípusoktól. Ez részben a vegetatív szaporítással tovább vitt mutációk eredménye. Ezenkívül voltak olyan genotípusok is, amelyek genetikailag annyira távoliak az alaptípusoktól, hogy a fajtához tartozásuk megkérdıjelezhetı, ezért az elnevezés tévesnek tekinthetı. Krichen és mts. (2006) 54 tuniszi tájfajtát vizsgáltak. Huszonhat primer alkalmazásával összesen 103 allélt detektáltak. A gyakorlati alkalmazhatóság céljából kiemelték azt a legjobb 6 primerpárt, amelyik elegendı polimorfizmust biztosított az összes fajta azonosításához. A kizárólag fajtaazonosító vizsgálatok mellett egyre inkább jellemzıvé vált a faj elterjedésének vizsgálata SSR markerekkel, melyek a rendelkezésre álló molekuláris markerek közül erre a célra a legalkalmasabbnak bizonyultak. Az ilyen célú kutatások egyik elindítója a BCE Genetika és Növénynemesítés Tanszéke volt. Az elsı, magyar fajták bevonásával végzett SSR vizsgálat már 2001-ben a nemzetközi kajszi szimpóziumon bemutatásra került. Az eredményeket tartalmazó kutatások teljes szövege azonban csak jóval késıbb került publikálásra (Romero és mts., 2006). A vizsgálat során arra a kérdésre keresték a választ, hogy a magyar fajták milyen közeli rokonságban vannak a dél-európai fajtakörrel. Összesen 20 vizsgált fajtából 10 Magyarországon termesztett, illetve további 10 észak-amerikai és dél-európai fajta volt.
38
Mind a 12 felhasznált ıszibarack primer polimorf fragmentumokat hozott létre, melynek segítségével sikerült a fajtákat megkülönböztetni. A kapott allélvariabilitás alapján készített dendrogram szerint a magyar fajták külön csoportot képeztek az északamerikai, valamint a dél-európai fajtáktól. A magyar fajtákon belül, két csoporton belül (Óriás kajszik és a Rózsakajszik) nagy hasonlóságot találtak. A kutatás bebizonyította, hogy az SSR-markerezés alkalmas a kajszi elterjedésének követésére. Mindenféleképpen
mérföldkınek
számít
a
kajszi
fajták
kultúrevolúciós
vizsgálatában Zhebentyayeva és mts. (2004) munkája. A munkacsoport 74 kajszi genotípust vizsgált, és az általában elterjedt fajtákon kívül jellemezni tudták a kajszibarack elsıdleges és másodlagos géncentrumából származó genotípusokat is. A kajszi elsıdleges és másodlagos géncentrumából származó minták az elvárhatónál kisebb genetikai diverzitást mutattak csoportjukon belül. Ennek ellenére a klaszteranalízis eredményei hően tükrözték a korábban orosz tudósok által leírt kajszi kultúrevolúciós útvonalakat. Az európai, ezen belül a magyar fajták a legnagyobb azonosságot az iráni-kaukázusi fajtákkal mutatták. Hasonló tanulmányokat végzett egy magyar, osztrák és portugál kutatókból álló nemzetközi csoport is. Százötven különbözı eredető fajta vizsgálatával a korábban leírt eredményeket megerısítették, de a kísérletben alkalmazott más fajtaösszetétel miatt lényeges megfigyeléseket tettek az amerikai fajtákat illetıen is. Vélelmezték, hogy az amerikai fajták, és ezen belül a PPV rezisztencianemesítés fı donorai nem tisztán európai eredető fajták. Az SSR-polimorfizmus alátámasztotta a korábbi feltételezést, amely szerint ezek a fajták ázsiai eredető génekkel is rendelkeznek. A genetikai távolságok alapján sikerült meghatározni a fajták közötti rokonsági köröket. Az európai fajták külön ágra kerültek a dendrogramon. Néhány fajta esetében a korábban is feltételezett szinonim nevek létezése megerısítést nyert. Ezek közé tartozott pl. a ‘Szegedi mamut’ és a ‘Ceglédi óriás’ fajta (Maghuly és mts., 2005; Pedryc és mts., 2006; Ruthner és mts., 2006) Az elıbbi megállapítások egybevágnak a Zhebentyayeva és mts. (2008) által tapasztaltakkal. Munkájukban az AFLP- és SSR-markerekkel bebizonyították, hogy az amerikai fajtákban létezı PPV rezisztencia forrása valószínőleg az Amerikába bekerült észak-kínai eredető genotípusokból származik. Bizonyítást nyert, hogy a ‘Stark Early
39
Orange’, ‛Goldrich’ és ‛Harlayne’ fajták genotípusaira jellemzı PPV rezisztencia génforrása vagy ugyanarra, vagy genetikailag nagyon közeli ısre vezethetı vissza. A fent említett filogenetikai tanulmányokat kiegészíthetik a jövıben azok a kínai kutatások, melyek célja a vad P. armeniaca populációk genetikai összetételének elemzése. A He és mts. (2007) által közölt eredmények szerint ezek a populációk még megtartották a genetikai variabilitásukat, bár veszélyeztetve vannak úgy a kultúrfajták genetikai inváziójától, mint az emberi környezet átalakító tevékenységétıl. Az elızıkben említett vizsgálati célok mellet (fajtaazonosítás, származásvizsgálat) kajsziban is alkalmaztak konkrét nemesítési célokra mikroszatellit markereket. Sánchez-Pérez és mts. (2005, 2006b) spanyol és néhány külföldi fajtát azonosítottak SSR-markerekkel. Tanulmányuk kiterjedt a vizsgált fajták néhány termesztési
szempontból
termékenyülési
viszonyok,
fontos
tulajdonságának
gyümölcsszín
és
(virágzási
-tömeg
stb.)
idı,
érési
jellemzésére
idı, is.
Összehasonlítva az SSR-variabilitás és a morfológiai bélyegek alapján nyert klasztereket, nem találtak közöttük szignifikáns kapcsolatot. Graetz (2006) az aszalásra alkalmas fajták elıállítását célzó nemesítési program során SSR-markerekkel jellemezte a nemesítési alapanyagokat. Vilanova és mts. (2006) PPV rezisztenciáért felelıs szakasz pontos
markerezése
érdekében
a
rezisztencia
géneket
tartalmazó
kajszi
1.
kromoszómáját telítette markerekkel. Hasonló meggondolásból Sicard és mts. (2007) kihasználva a Prunus térképezés eddigi eredményeit, primereket terveztek a kajszibarack potenciális rezisztenciagénjeire (candidate resistance genes). Nagyon jelentıs célnak tekinthetı, hogy azt a sok eredményt és tapasztalatot, amelyet az egymástól függetlenül mőködı kutatócsoportok létrehoztak, valamilyen módon egységesíteni lehessen. A célt felismerve egyre több olyan tanulmány születik, melyek az SSR markerek integrált genetikai térképekre való beiktatásával foglalkoznak. A Prunus nemzetségben a korábban említett Abbott és mts. (2002) indítványozták az ilyen irányú munkát egy nemzetközi konzorcium szervezésével. A térképezés eredményeit többek között bemutatták Dirlewanger és mts. (2004), illetve legutóbb Jung és mts. (2008). A kajszibarack markereit Dondini és mts. (2007) beillesztették az eddig összeállított, integrált Prunus genetikai térképre. A Prunus nemzetségben molekuláris markerekkel azonosított minıségi és mennyiségi tulajdonságokat a 4. és 5. táblázat tartalmazza.
40
4. táblázat: A molekuláris markerekkel azonosított fontosabb monogénes tulajdonságok a Prunus nemzetségben (Martinez-Gomez és mts., 2005)
Faj İszibarack
Mandula
Kajszi
Cserenye/ meggy Szilva
Tulajdonság Levélszín Levélszín Levél mirigyezettsége Dupla virág Hímsterilitás Héj szırözöttsége Héj szırözöttsége Héjszín Lapított gyümölcs Hússzín Hússzín Hússzín Magvaválóság
Marker RAPD SSR RFLP
Savtartalom Magvaválóság Savtalan gyümölcs Savtalan gyümölcs Nematóda rezisztencia Nematóda rezisztencia Nematóda rezisztencia Nematóda rezisztencia Nematóda rezisztencia Önmeddıség Öntermékenyülés Mandulabél íze Héj keménysége Késıi virágzás PPV rezisztencia
AFLP AFLP RAPD RFLP AFLP
Hivatkozás Chaparro és mts., 1994 Yamamoto és mts., 2001 Dettori és mts., 2001; Quarta és mts., 2000 Sosinski és mts., 2000 Dirlewanger és mts., 1999 Dirlewanger és mts., 1999 Bliss és mts., 2002 Yamamoto és mts., 2001 Dirlewanger és mts., 1999 Wartburton és mts., 1996 Abbott és mts., 1998 Bliss és mts., 2002 Abbott és mts., 1998; Dettori és mts., 2001; Quarta és mts., 2000 Wu és mts. 2004 Yamamoto és mts., 2001 Dirlewanger és mts., 1999 Bliss és mts., 2002 Abbott és mts., 1998; Lu és mts., 1998
STS
Lu és mts., 1999
AFLP
Yamamoto és Hayashi, 2002
STS
Yamamoto és Hayashi, 2002
AFLP
Blenda és mts., 2002
RFLP RFLP RFLP RFLP RAPD SSR
PPV rezisztencia Önmeddıség Hímsterilitás Önmeddıség Önmeddıség Törpe habitus Nematóda rezisztencia Nematóda rezisztencia
AFLP RAPD RAPD EST EST RFLP RAPD
Joobeur és mts., 1998 Arús és mts., 1999 Bliss és mts., 2002 Arús és mts., 1999 Ballester és mts., 2001 Hurtado és mts., 2002b; Vilanova és mts., 2003 Salava és mts., 2001 Badenes és mts., 2000 Badenes és mts., 2000 Tao és mts., 1997 Sonneveld és mts., 2001 Arús és mts., 1999 Salesses és mts., 1998
SCAR
Lecouls és mts., 1999
AFLP AFLP AFLP RFLP SSR RFLP RAPD AFLP RFLP RFLP
41
5. táblázat: A molekuláris markerekkel azonosított fontosabb poligénes tulajdonságok a Prunus nemzetségben (Martinez-Gomez és mts., 2005)
Faj Tulajdonság İszibarack Levélsodródás rezisztencia Internódium hosszúsága Lisztharmat rezisztencia Virágzási idı
Mandula Cserenye/ meggy
Marker Hivatkozás RAPD Viruel és mts., 1998 RFLP RFLP RFLP
Érési idı
RFLP
Érési idı Érési idı Gyümölcsérés ciklusa Gyümölcsérés ciklusa Termıképesség Gyümölcs átmérı Gyümölcs tömege Gyümölcshéj színe Gyümölcshéj színe pH Titrálható savtartalom
SSR SSR RFLP SSR RFLP AFLP RFLP RFLP SSR RFLP RFLP
Almasav-tartalom
RFLP
Citromsav-tartalom
RFLP
Vízoldható anyagok Vízoldható anyagok Fruktóz tartalom Fruktóz tartalom Glükóz tartalom
RFLP SSR AFLP RFLP RFLP
Héj keménysége Virágzási idı Érési idı Gyümölcs tömege Vízoldható anyagok
RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP
Verde és mts., 2002 Quarta és mts., 2000 Dirlewanger és mts., 1999; Quarta és mts., 2000; Verde és mts., 2002 Quarta és mts., 2000; Dirlewanger és mts., 1999 Verde és mts., 2002 Etienne és mts., 2002 Abbott és mts., 1998 Etienne és mts., 2002 Dirlewanger és mts., 1999 Abbott és mts., 1998 Abbott és mts., 1998; Etienne és mts., 2002 Quarta és mts., 2000 Verde és mts., 2002 Abbott és mts., 1998; Etienne és mts., 2002 Dirlewanger és mts., 1999; Etienne és mts., 2002 Dirlewanger és mts., 1999; Etienne és mts., 2002 Dirlewanger és mts., 1999; Etienne és mts., 2002 Abbott és mts., 1998; Quarta és mts., 2000 Etienne és mts., 2002; Verde és mts., 2002 Abbott és mts., 1998 Etienne és mts., 2002 Abbott és mts., 1998; Dirlewanger és mts., 1999; Etienne és mts., 2002 Arús és mts., 1999 Wang és mts., 2000 Wang és mts., 2000 Wang és mts., 2000 Wang és mts., 2000
42
3
A KUTATÁS ELİZMÉNYEI ÉS CÉLJAI A kajszi molekuláris markerezése a kilencvenes évek elején kezdıdött a jogelıd
Kertészeti Egyetem Genetika és Növénynemesítés tanszékén. Sokáig egy léghőtéses, kezdetleges PCR készülék, néhány futtatókád, valamint egy Polaroid gélfotózásra alkalmas készülék jelentette az egyedüli laborhátteret. Kezdetben szakkörös, majd Ph.D hallgatóként lépésrıl-lépésre haladva csak lassan, három-négy évvel ezelıtt sikerült azokat a feltételeket megteremteni, amellyel a molekuláris markerezés rutinszerően végezhetı. A vizsgálataim végzésének idején azonban még nem állt rendelkezésre a szükséges magas színvonalú technikai háttér és tapasztalat. Az elırelépés a saját fejlesztéseink mellett elsısorban annak volt köszönhetı, hogy megfelelı partneri kapcsolatokat sikerült kiépítenünk hazai és külföldi intézményekkel. Még egyetemi hallgatóként 2000-ben 8 hónapot töltöttem a Michigan State University Kertészeti Genetika tanszékén, ahol a meggy Blumeriella jappii rezisztenciához kapcsolt mikroszatellit markerek azonosításával foglalkoztam. Itt sikerült elsajátítanom azokat a technikai ismereteket, melyek nagyban segítettek a késıbbi munkámban. A kajszi molekuláris vizsgálatához a következı segítséget a Valenciai Mezıgazdasági Kutató Intézetben kaptuk, ahol 2002-ben közel egy hónapot töltöttem. Az intézetben kifejlesztett, illetve tesztelt ıszibarack mikroszatellit primereket használtuk a hazánkban termesztett kajszik és nemesítési alapanyagok jellemzésére. A munkát közös publikációval zártuk. A mikroszatellit kutatás következı munkái a bécsi BOKU egyetemmel kialakított közös projekt keretén belül zajlottak. Eközben sikerült olyan mértékben fejleszteni a tanszék
laboratóriumi
hátterét,
megszerezni
és
saját
laboratóriumunkban
is
hozzáférhetıvé tenni a munkához nélkülözhetetlen tudást, hogy lehetıvé vált a kutatás egy részét közvetlenül tanszékünkön elvégezni. Az osztrák-magyar projekt eredményei 2005-ben, az akkor újonnan induló Tree Genetics & Genomes (Springer) címő szakfolyóiratban kerültek közlésre, mely lapot azzal a szándékkal hívták életre, hogy a tudományterületen nagy tekintélynek örvendı Theoretical and Applied Genetics fás kultúrák irányába szakosodott társfolyóirata legyen.
43
A hazai vizsgálatokhoz nagy segítséget kaptunk az Országos Mezıgazdasági Minısítı Intézettıl, ami a referencia győjteményébıl engedélyezte a minták begyőjtését, valamint a fragmentumhossz analízishez az ABI 310 szekvenátor készülékét is a rendelkezésünkre bocsátotta. A kísérleti célokat és az elért eredményeket mindenféleképpen ezeknek az elızményeknek ismeretében célszerő értékelni, hiszen elképzeléseinknek, fantáziánknak többnyire anyagi korlátok, illetve a megfelelı laborfelszereltség hiánya szabott határt, késleltette a megvalósításukat.
A munkánk során az alábbi célokat tőztük ki:
1.
A rendelkezésre álló laborháttérre és a kajszi növényre alkalmas rutinszerő DNS-izolálási eljárás adaptálása.
2. A Magyarországon árutermesztési célból termesztett kajszifajták azonosítása, és egyedi DNS-ujjlenyomat készítése RAPD és SSR markerekkel. 3. İszibarackra és kajszibarackra tervezett SSR primerkészletek összehasonlítása a kajszi genetikai sokféleségének vizsgálatában. 4. Az eltérı kajszi ökoföldrajzi fajtacsoportok genetikai kapcsolatának követése mikroszatellit markerekkel. 5. A közép-európai fajtakör variabilitásának vizsgálata és összehasonlítása a fı fajtacsoportok polimorfizmusával.
44
4
ANYAG ÉS MÓDSZER
4.1
Növényanyag A vizsgált fajták és hibridek a Budapesti Corvinus Egyetem Genetika és
Növénynemesítés Tanszék Szigetcsépi ültetvényébıl, az MgSzH (volt OMMI) referencia győjteményébıl, a Mendel Egyetem (Csehország) lednicei ültetvényébıl, a Ceglédi Gyümölcstermesztési Kutató-Fejlesztı Intézet génbankjából, a Kecskeméti Fıiskola gyümölcsültetvényébıl, a BOKU Egyetem (Bécs) génbankjából, illetve Laimburgból és Ferraraból (Olaszország) származnak (6. táblázat).
4.2
DNS-izolálás Az analízishez szükséges teljes genomi DNS-t 0,1 g áprilisban és májusban
győjtött fiatal kajszilevélbıl izoláltuk három módszer tökéletesítése révén. A RAPD analízishez javított CTAB módszert, míg az SSR markeres vizsgálatokhoz a Qiagen cég által kifejlesztett DNeasy Plant Mini Kitet használtuk. A DNS mennyiségét spektrofotometriás úton mértük (GeneQuant II RNA/DNA) és higítottuk a reakcióhoz szükséges megfelelı koncentrációra.
4.3
RAPD analízis A vizsgálatba az állami elismerésben részesített, a nemzeti leíró fajtajegyzékben
szereplı összesen 16, Magyarországon legnagyobb területen termesztett fajtát vontunk be. A 16 fajtából hét árufajta, öt választékbıvítı fajta, valamint négy próbatermesztésre ajánlott fajta volt. A kísérlet során az OPERON Co. által szintetizált B, C és O primerkit-et használtuk. Egy-egy kit 20 db, egyenként tíz nukleotidos primert tartalmaz. A kiválasztott 8 primer szekvenciáját, a reakcióelegy összetételét, valamint a felhasznált programot a 7. táblázat tartalmazza. A kísérletünkben a polimorf mintázatot ígérı reakciókat négyszer, ötször megismételtük, és csak a legélesebben megjelenı és reprodukálható fragmentumokat használtuk markerként. Az amplifikált mintákat 1%-os agaróz gélen választottuk el, majd az eredményeket ethidium-bromidos festési eljárással tettük láthatóvá. A kapott fragmentumokat 100 bp (Promega) méretmarkerrel vizuálisan értékeltük, és polaroid kamerával archiváltuk.
45
Callatis
Ceglédi arany Ceglédi bíborkajszi Ceglédi kedves Ceglédi óriás Ceglédi Piroska
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
18
19 20 21 22 23
6
AIA 0-10 AIA 0-28 AIA 0-68 Albena Ananasznij cjurpinszkij Andornaktályai magyar kajszi Arvam aramat Bachinger Bebeco Bergeron Bhart Borjana Borsi-féle kései rózsa Bronzovij Budapest Bukurija Csacsanszko zlato
1 2 3 4 5
Fajta
Mo. Mo. Mo. Mo Mo.
Rom.
K-Á. K-E. Gro. Fro. USA Mol. Mo. Ukr. Mo. Mol. Szb.
Mo.
Ol. Ol. Ol Mo. Ukr.
Sz. Sz. T. T Sz.
Sz.
L. B. Sz. T. B. T. T. Sz. Sz. Sz. T.
T.
F F F T. Sz.
Ismeretlen Magonc Véletlen magonc Véletlen magonc (1920) Lasgerdi Mashhadi × NJA2 Magyar kajszi × Jerevani Ismeretlen, Kecskemét Khurmai × Krasznij partizan Nancy × (Acme, Magyar kajszi, Kései rózsa) Salah szabadbeporzású magonca Magyar kajszi tájszelekciója (Tarzii de Bukuresti × Ananas) × (Luizet × Umberto) Rózsabarack C. 1668 × Ceglédi óriás Véletlen magonc Ceglédi óriás szabadbeporzású magonca Tájszelekció, Izsák (1953) Ceglédi óriás × Magyar kajszi C.1789
Magyar kajszi tájszelekciója
Magonc Magonc Magonc Szilisztrenszka kajszija × Krasznoscsokij Ismeretlen
Származás Génbank Pedigré1,2,3
S, Kny, -, Ngy, GyÍ SN, P, MÉ, Ngy, GyÉ Ncs, Kny, -, Kz, GyÍ SN, KKny, MÉ, Ngy, GyÍ Ncs, KKny, MÉ, Kz, -
Ncs, KKny, -, Ngy, -
? ViN, Kny, -, Kz, GyS ViN, Kny, MKő, Ngy, GyÍ Ncs, Kny, MÉ, Kz, GyÍ SN, KKny, MÉ, Ngy, ? Ncs, Kny, -, Kcs, Ncs, -, MÉ, Kz, ViN, Kny, -, Ngy, GyS ViN, P, MÉ, Kcs, -, -, -, Ngy, -
SN, KKny, MÉ, -
S, Kny, -, Ngy, GyÉ S, KKny, -, Kz, GyÉ Ncs, Kny, -, Kz, GyS SN, KKny, MÉ, Kz ViN, KKny, MÉ, Kz, GyÉ
Pomológiai tulajdonságok1
SC SC SC SI SI
SC
? SC SC SC SI ? SC ? SC SI SC
SC
46
Termékenyülés2,3 SC SC SC ? SC
6. táblázat: A dolgozatban vizsgált fajták és hibridek származása, a mintagyőjtés helyszíne, a fajták pedigréje, jellemzı agronómiai tulajdonságaik és termékenyülési fenotípusuk
Chersonszkij 1469 CIV 1. Comandor Crvena Ungarska Darunek malahojeva Dionis 1482 Dolgocsukna Dr. Mascle Effekt Salah Fesztival Goldrich Gönci magyar kajszi Gulkin
Harcot
Harmat Hunza Junszkij Kalasek Karim-Abad Karola Kecs-psár Kecskemét (késıi) Kecskemét (korai) Kjurmai Kijevszkij aromatij
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
38
39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
Fajta
Mo. P. Mol. Cso. P. Szlo. Üzb. Mo. Mo. K-Á. Ukr.
Kan
Ukr. O. Rom. Mac. Ukr. Ukr. K-E Fro. Ukr. Örm. UKR USA Mo P.
Sz. B Sz. L. B. L. Sz. T. T. L. Sz.
T.
Sz. F. Sz. T. T Sz. Sz. B. Sz. Sz. Sz. Sz. T. B.
Magyar kajszi klón Magonc Marculesti 17/52 × Marculesti 43/1 Magyar kajszi szelektált klónja Ismeretlen Salah × Kok-psár Magyar kajszi szelektált klónja Ismeretlen Krupnolodnij szabadbeporzású magonca Örmény tájfajta Ismeretlen Sunglo × Perfection Magyar kajszi szelektált klónja Magonc (Geneva × Narmata) × Morden 604 × NJA1 (Perfection × Phelps) (1977) Salah szabadbeporzású magonca Magonc Salah szabadbeporzású magonca Magyar kajszi szelektált klónja Magonc Koloboucka × Velkopavlovicka Helyi fajta Véletlen magonc Véletlen magonc Ismeretlen ?
Származás Génbank Pedigré1,2,3
Ncs, P, MKő, Kz, Ncs, Kny, MÉ, Kcs, GyÉ S, P, MÉ, Kcs, SN, Kny, MÉ, Kz, GyÍ Ncs, Kny, MÉ, Kcs, GyÉ SN, Kny, -, Kz, S, Kny, MÉ, Kz, ViN, Kny, -, Kz, ViN, Kny, -, Kz, GyS S-Ncs, P, MÉ, Kz, GyÉ ?
SN, Kny, MÉ, Kz, GyÉ
SN, KKny, MÉ, Kz, ? SN, KKny, MÉ, Ngy SN, Kny, MÉ, Kz, GyÍ ? ViN, P, -, Kcs, ? ? S, KKny, MÉ, Ngy, ViN, Kny, MÉ, Ngy, GyÉ ? Ncs, Kny, -, Ngy, SN, P, MÉ, Kz, GyÉ Ncs, Kny, MÉ, Kcs, GyÉ
Pomológiai tulajdonságok1
SI SI? SC SC SI? SC SI SC SC SI ?
SI
47
Termékenyülés2,3 SC ? SC SC SC ? SC ? SC SI ? SI SC SI?
73
72
71
70
50 51 52. 53. 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
Kletnice Klosterneuburger Konkurencia Konzervnij podznij Korai Piros Korai Zamatos Krasznoscsokij Krimszkij Amur Kâszna ungarska Kuresia Ligeti óriás Litoral Luizet M2000 m Magyar kajszi C.235 Mandulakajszi Mari de Cenad Marille Moniquí Morden 604 MT 6/17 (T-6, transzgénikus) MT 8/9 (T-8, transzgénikus) Murfatlar Nagygyümölcső m. kajszi
Fajta
Mo
Rom
K-Eur
K-Eur
Cso. Au Ukr. Ukr Mo. Mo. Ukr. Ukr. Bul Eu, ÉA Mo. Rom. Fro. Pak Mo. Mo. Rom. K-E. Spo Kan
T
Sz.
B
B
L. B. L. Sz. Sz. Sz. Sz. T. T. B. T. Sz. F B T T Sz. B Sz Sz
Magyar kajszi szelektált klónja
?
Kései kecskeméti szabadelvirágzású utódja
Kései kecskeméti szabadelvirágzású utódja
Helyi szelektált klón Ismeretlen magonc Effekt × Priuszadebnij rannij Véletlen magonc Ismeretlen eredető tájfajta Jubilar szabadbeporzáső magonca Magyar kajszi szelektált klónja Mulla sadik × Udarnik Magyar kajszi szelektált klónja ? Tájszelekció, Dózsamajor (1959) (Luizat × Umberto) × (Ananas × Ananas) Ismeretlen magonc ? Magyar kajszi szelektált klónja Ismeretlen (1954) Ismeretlen eredető helyi fajta Ismeretlen magonc ? Ismeretlen
Származás Génbank Pedigré1,2,3
SN, Kny, MÉ, Kz, GyÍ
ViN, -, -, Kcs, -
?
?
ViN, KKny, MÉ, Kz, GyÉ ViN, Kny, MKő, Kz, GyÉ Ncs, -, MÉ, Kz, SN, KKny, MÉ, Ngy, Ncs, P, MÉ, Kcs, Ncs, KKny, MÉ, Kz, GyÉ SN, KKny, MÉ, Ngy, Ncs, Kny, MÉ, Ngy, SN, -, MÉ, Kcs, ViN, Kny, -, Kz, GyÉ-GyS Ncs, KKny, MÉ, NNgy, ? ViN, Kny, MÉ, Kz, GyÉ ? SN, Kny, MÉ, Kz, GyÍ Ncs, KKny, MÉ, Ngy, GyÍ Ncs, KKny, -, Ngy, ViN, -, -, Kz-Ngy S, P, MKő, NNgy, GyÉ S, P, -, Kcs, -
Pomológiai tulajdonságok1
SC
?
SC
SC
48
Termékenyülés2,3 SC SC ? SC SC SI SC SC SC SC SI ? SC ? SC SC SC SC SI SC?
74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
Narjadnij Nyikitszkij P.x dasycarpa Paksi magyar kajszi Paszinok Pieber (13,15,17) Pisana Plumcot Poldij junszkij Polonaise Priana Priuszadebnij rannij P. brigantica Rakovszky Rakvice Rana Dokucana Rosensteiner Rouge de Sernhac Rózsakajszi C.1406 Sabinovska Szamarkandszkij rannij San Caestre Selena Silvercot Sirena Spätblühende Koch Sulmona
Fajta
Ukr. Ukr. Ol. Mo. Ukr K-E. Ol. USA Mol Fro. Fro Ukr. Fro. Mo. Cso K-E. K-E. Fro. Mo. Szlo. K-Á. Ol. Rom. USA Rom. K-E. Rom.
Sz Sz. B T. Sz. B Sz. Sz. Sz. Sz. F. Sz. B. T. L. L. B. B. T. L. Sz. F. T. B. Sz. B. Sz.
Oranzsevo Krasznij × Shirazkij Krasznocsokij szelektált klónja P. cerasifera × P. armeniaca Magyar kajszi szelektált klónja Vinoszlivij × Salah Ismeretlen Toscaniai korai önbeporzás P. armeniaca x P.saliciana Véletlen magonc Canino × Hamidi Szamarkandszkij rannij × Krasznoscsokij Ismeretlen Véletlen magonc, Kocsóc Ismeretlen Ismeretlen Magonc Véletlen magonc Tájszelekció, Nagykırös Magyar kajszi szelektált klónja Krasznoscsokij × Majszkaja szkoroszpelka Ismeretlen (Luizet × Umberto) × (Ananas × Ananas) Új nemesítéső fajta (Ananas × Ananas) × (Luizet × Umberto) ? (Luizet × Umberto) × (Ananas × Ananas)
Származás Génbank Pedigré1,2,3 ViN, -, MKő, Kz, ? ? SN, KKny, MÉ, Kz, ViN, KKny, MÉ, Kz, ? Ncs, KKny, -, Ngy, ViN, Kny, MÉ, Kz, GyÉ S, P, -, Kcs, ViN, P, MÉ, Kcs ? SN, -, MÉ, Kz, ? ? ViN, Kny, -, Kz, GyS ViN, Kny, MKő, Kz, GyÉ Ncs, KKny, -, Kz, GyÉ ? Ncs, KKny, MÉ, Kcs, GyÉ SN, Kny, -, Ngy, SN, KKny, -, Ngy, GyÍ ? -, -, -, Ngy, SN, -, -, Ngy, GyÉ Ncs, KKny, -, Ngy, -
Pomológiai tulajdonságok1
49
Termékenyülés2,3 ? SC ? SC SC SC SC ? SC SI SI? ? SC ? ? SC? SC SC SC SI SC SC ? SC SC SC
USA Ukr. Cso. Rom. K-E. Ol. Ukr. Ukr. Ukr. Ukr.
109 110 111 112 113 114 115 116 117 118
2,
Maghuly és mts., 2005. Halász, 2007 3, Halász és mts., 2007.
1,
119 Zard
Üzb.
K-E.
108 VAV B1
Veecot Velkij Velkopavlovicka Venus Vesna Vinschger Marille Vnuk partizana Vognic Voszki Zaposzdolje
Ukr.
107 Uzsgorod
Mo. K-E. K-E. USA Rom.
K-E.
Szegedi mamut Szilisztrenka kompotna Szkopszka krupna Tilton Tomis
Sz.
Sz. L. L. Sz. F B. Sz. L. Sz. Sz.
B.
T.
B.
Sz. Sz. Sz. B. T. Ncs, KKny, MÉ, Ngy, GyÍ SN, Kny, MÉ, Kz, GyÍ SN, Kny, MÉ, Kz, GyÍ S, Kny, MÉ, Ngy, -, -, -, ENgy, VöN, Kny, MÉ-MKő, Kz, GyÉ-GyS ? ViN, Kny, -, Kz-Ngy, GyÉGyS VöN, Kny, MKő, Kcs, GyÉ ? SN, KKny, MÉ, Kz, GyÍ Ncs, KKny, -, Ngy, Ncs, Kny, -, Ngy, ViN, KKny, MÉ, Kz, GyÉ ViN, KKny, MÉ, Ngy, ? S, KKny, -, Ngy, Ncs, -, MÉ, Kz, -
Pomológiai tulajdonságok1
Reliable szabadmegporzású magonca Ismeretlen Magyar kajszi szelektált klónja (Umberto × Ananas) × (Luizet × Umberto) Magyar kajszi szabadmegporzású magonca Helyi fajta Krasznij partizan szabadmegporzású magonca Ismeretlen Sateni szabadmegporzású magonca Ismeretlen Zardalju szabad megporzású magonca, VIR S, P, -, Kcs, intézet
Ismeretlen
Ismeretlen
Magyar kajszi szelektált klónja
Tájszelekció? Magyar kajszi szelektált klónja Magyar kajszi szelektált klónja Ismeretlen Ismeretlen
Származás Génbank Pedigré1,2,3
106 Ungarische Beste
101 102 103 104 105
Fajta
SI
SI ? SC SC SI SC ? ? SI SC
SC
?
SC
50
Termékenyülés2,3 SI SC SC SC? ?
6. táblázat rövidítéseinek magyarázata: Származás: Au.: Ausztria; Bul.: Bulgária; Cso.: Csehország; Fro.: Franciaország; Gro.: Görögország; Kan.: Kanada; K-Á.: Közép-Ázsia; K-E.: Kelet-Európa; Mac.: Macedónia; Mo.: Magyarország; Mol.: Moldávia; Ol.: Olaszország; P.: Pakisztán; Rom.: Románia; Szb.: Szerbia; USA: Amerikai Egyesült Államok; Ukr.: Ukrajna; Üzb.: Üzbegisztán Győjtési hely B.: Bécs; F.: Ferrara; L.: Lednice; Sz.: Szigetcsép; T.: Tordas Gyümölcsszín: ViN: világos narancs, SN: sötét narancs, S: sárga, Ncs: narancs, VöN: vörös narancs Gyümölcs konzisztencia: Kny: kemény, P: puha, KKny: közepesen kemény A magház íze: MÉ: édes, MKő: keserő Gyümölcsméret: ENgy: extrém nagy, NNgy: nagyon nagy, Ngy: nagy, Kz: közepes, Kcs: kicsi Gyümölcsíz: GyÉ: édes, GyS: savas, GyÍ: ízletes 7. táblázat: A RAPD reakció paraméterei és a felhasznált primerszekvenciák
A PCR reakció lépései A PCR reakció elegy összetétele: 94°C 2 perc Komponens Koncentráció. 1. 92°C 1 perc Primer 25 pmol 2. DNS templát 33°C 1 perc 3. 30 ng/µl 1.30 DNA Red Taq polimeráz 72°C 1 unit 4. perc 72°C 2 perc dNTP mix 10 mmol 5. 4°C 10x puffer 1,5 m MgCl2 6. Steril H O 40 cikluson keresztül 2 A polimorf mintázatot eredményezı primerek bázissorrendje Primer név Szekvencia OPB-08 5’-GTC-CAC-ACG-G-3’ OPB-09 5’-TGG-GGG-ACT-C-3’ OPB-16 5’-TTT-GCC-CGG-A-3’ OPC-06 5’-GAA-CGG-ACT-C-3’ OPC-11 5’-AAA-GCT-GCG-G-3’ OPC-14 5’-TGC-GTG-CTT-C-3’ OPC-15 5’-GAC-GGA-TCA-G-3’ OPC-20 5’-ACT-TCG-CCA-C-3’
51
4.4
SSR analízis fajtaazonosítási céllal A kutatásban a már korábban ismertetett és a RAPD analízishez használt 16 fajtát
használtunk. A kísérletben 8 db kajszi fluoreszcens végjelöléső (Cy5) mikroszatellit primerpárt (Lopes és mts., 2002) használtunk az adott primerre közölt PCR programokkal (8. táblázat). A korábban publikált kajszimarkerezési kutatásoktól eltérıen elsıként nyílt lehetıségünk kajszispecifikus primerek használatára (12. táblázat). Az amplifikált mintákat elıször 3%-os BMA MetaPhor agaróz gélen vizuálisan 25 bp méretmarker (Promega) kíséretében ellenıriztük, majd a sikeres reakciótermékeket 6%-os denaturáló poli-akril-amid gélen Amersham Pharmacia ALF Express szekvenáló készülékkel választottuk szét. A fragmentumok hosszának pontos meghatározása érdekében az amplifikált termékek mellett méretstandardot (100, 200 és 300 bp) és ismert mérető mintát futtattunk belsı standardként. A gélek értékeléséhez a Fragment Analyser 1.03 (Amersham-Pharmacia) szoftvert alkalmaztunk.
8. táblázat: A felhasznált PCR program paramétererei
A PCR reakció lépései A reakció komponensei Komponens Koncentráció 1. 96°C 5 perc 2. 96°C 40 s Primer F+R 10 pmol DNS templát 3. * 40 s 10 ng/µl 4. 72°C 1 perc DNA Taq polimeráz 0,5 unit 5. 72°C 10 perc** dNTP mix 10 mmol 6. 4°C 10x puffer 1,5 mM MgCl2 40 cikluson keresztül Steril H2O * a primernek megfelelı annealing hımérséklet
52
4.5
SSR analízis ıszibarack mikroszatellit primerekkel A kísérletbe negyvenöt olyan kajszifajtát állítottunk, melyeket Közép-Európában
termeszthetıség szempontjából értékesnek találtunk. A kiválasztott fajták között szerepelt a tizennégy legnagyobb területen termesztett fıfajta, valamint 6 további, az ún. magyar kajszi fajtakörhöz tartozó, vagy vele vélhetıen szoros kapcsolatban lévı fajta. A fennmaradó fajták eltérı származásúak, ami közös bennük, hogy mindegyikük fontos szerepet játszik tanszékünk nemesítési programjában, ezáltal, mint nemesítési alapanyag kiinduló pontjai a jövı fajtáinak. Mindezen felül referenciaként felhasználtunk néhány olyan világfajtát is, mint pl. a ‘Bergeron’, vagy a ‘Moniquí’. A PCR reakciót 18 ıszibarackra és 1 kajszira kifejlesztett mikroszatellit primerrel végeztük (9. táblázat) MJ research PTC 200 típusú PCR készülékkel és programmal (10. táblázat). Az amplifikált PCR termékeket 3%-os Metaphor agaróz (Biowhittaker Maine, USA) gélen választottuk el 1x TBE (89 mM Tris, 89 mM borsav, és 2 mM EDTA (pH 8.0) futtató pufferrel. Az amplifikátumokat 0,7 µg/ml ethidium-bromid festéssel tettük láthatóvá UV fény alatt. A fragmentumokat 100 bp méretmarkerrel (Promega) vizuálisan azonosítottuk. A genetikai távolsági mátrixot a Reynolds és mts. (1983) által kifejlesztett, hasonló allélok arányát felhasználó módszerrel készítettük MICROSAT programmal (Minch és mts., 1997). Az UPGMA klaszteranalízist a NEIGHBOR program PHYLIP 3.5c verziójával végeztük (Felsenstein és mts., 1989). A dendrogramot a TREEVIEW programmal szerkesztettük (Page, 1996). Ezenkívül meghatároztuk a lókuszonkénti allélszámot, valamint a megfigyelt heterozigótaságot (a heterozigóta genotípusok száma osztva az összes genotípussal).
53
9. táblázat: A felhasznált ıszibarack SSR primerek és származásuk
•
Lókusz BPPCT007
Referencia Dirlewanger és mts., 2002
Primer származás ıszibarack
BPPCT009
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
BPPCT011
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
BPPCT017
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
BPPCT029
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
BPPCT030
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
BPPCT037
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
Pchgms10
Wang és mts., 2002
ıszibarack
Pchgms12
Wang és mts., 2002
ıszibarack
Pchgms14
Wang és mts., 2002
ıszibarack
Pchgms20
Wang és mts., 2002
ıszibarack
MA006b
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
MA009b
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
MA010a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
MA013a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
MA019a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
MA027a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
MA030a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
Ac7b
Nem publikált.*
kajszi
Badenes és kutató csoportja által kifejesztett primer (Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias IVIA)
10. táblázat: A felhasznált PCR program paramétererei
A PCR reakció lépései 1. 94°C 3 perc 2. 94°C 45 mp 3. 50°C 60 mp 4. 72°C 1.15 perc 5. 72°C 10 min 6. 4°C 40 cikluson keresztül
A reakció komponensei Komponens Koncentráció F+R Primer 10 pmol DNS templát 10 ng/µl DNA Taq polimeráz 0,5 unit dNTP mix 10 mmol 10x puffer 1,5 mM MgCl2 Steril H2O -
54
4.6
SSR analízis kajszi mikroszatellit primerekkel A vizsgálatban 133 kajszi genotípust, a P. brigantiaca fajt, valamint két
interspecifikus hibridet, a P. x dasycarpa-t és a Plumcotot jellemeztük. A kísérletbe vont fajták megfelelıen reprezentálták az Európában, az iráni-kaukázusi régióban, Közép-Ázsiában és Észak-Amerikában termesztett különbözı származású kajszikat. Két különbözı forrásból származó, kajszira tervezett 10 mikroszatellit primert alkalmaztunk (12. táblázat), a PCR reakció körülményeit a primereknek megfelelıen optimalizáltuk (11. táblázat).
11. táblázat: A felhasznált PCR program paraméterei
A PCR reakció lépései A reakció komponensei 1. 95°C 15 perc Komponens Koncentráció 2. 95°C 50 mp F+R Primer 8 pmol DNS templát 3. * 60 mp 25 ng/µl 4. 72°C 60 mp DNA Taq polimeráz 0,5 unit 5. 72°C 10 min dNTP mix 8 mmol 6. 4°C 10x puffer 2 mM MgCl2 35 cikluson keresztül Steril H2O * a primernek megfelelı annealing hımérséklet Az amplifikált mintákat elıször agarózgélen ellenıriztük, majd a sikeres reakciótermékek fragmentumméreteit ABI 3100 kapilláris szekvenátorral és ABI Genotyper 3.7 szoftverrel határoztuk meg. Minden vizsgált mikroszatellit lókusz allélösszetételét meghatároztuk a 136 vizsgált genotípusban. Az egyes allélokat alfabetikus sorrendbe rendeztük (‘A’ a legkisebb stb.). A POPGENE 1.32 programot használtuk a következı értékek kiszámításához: a lókuszok allélgyakorisága, allélszám, beltenyésztési együttható (FST), génáramlás (Nm=0,25(1/ FST-1) (Nei, 1978). Meghatároztuk a várható heterozigótaságot (He = 1-∑pi2, ahol pi az i. allél gyakorisága) (Nei, 1973) és a megfigyelt heterozigótaságot (Ho, a heterozigóta genotípusok száma osztva az összes genotípus számával). A mikroszatellitek által kapott értékek alapján kalkuláltuk a genetikai azonosságot (I), valamint a genetikai távolságot (D) (Nei, 1972; Nei, 1978). A genetikai távolságok alapján az UPGMA klaszteranalízist az NTSYS programmal végeztük (Rohlf, 1993). A dendrogramot a TREEVIEW programmal
55
készítettük (Page, 1996). A párok közti távolságot a 133 vizsgált kajszifajta között PAUP (4. verzió) programmal számoltuk ki. 12. táblázat: Az 1. és 3. mikroszatellit kísérletekben felhasznált kajszi SSR primerek
Lókusz ssrPaCITA2 1
Várható hossz (bp) 219-249
Referencia Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA7 1,3
186-224
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA10 1,3
142-212
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA15 1
232-262
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA19 1,3
98-148
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA23 1,3
112-157
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA27 1,3
224-266
Lopes és mts., 2002
UDAp-407 3
118-162
Messina és mts., 2004
3
116-146
Messina és mts., 2004
UDAp-414 3
150-214
Messina és mts., 2004
UDAp-415 3
139-143
Messina és mts., 2004
UDAp-420 3
154-261
Messina és mts., 2004
UDAp-410
1
kísérletben felhasznált primerek, 3 kísérletben felhasznált primerek
56
5
EREDMÉNYEK
5.1
DNS kivonási eljárás adaptálása kajszira Rügypattanás után begyőjtött leveleket használtunk fel a DNS-izoláláshoz. A
vizsgálatok során három módszert adaptáltunk a kajszi növényre. A protokollok módosítását követıen mindhárom módszerrel sikerült PCR-reakcióhoz alkalmas minıségő, és a sorozatvizsgálatokhoz elegendı mennyiségő DNS-t izolálnunk (1. ábra). Az egyes módszerekkel kapcsolatos elınyöket és hátrányokat mérlegelve végül is a Qiagen cég által kifejlesztett DNeasy Plant Mini Kitet választottuk a késıbbi vizsgálatokhoz. A DNS-kivonási eljárás során 1 g friss levélszövetet folyékony nitrogénben homogenizáljuk, majd a Qiagen által elıállított pufferekkel eltávolítjuk a fehérje, polifenol és egyéb eredető szennyezıdéseket. A többszöri inkubációs lépések és centrifugálások után az izolált DNS-t speciális DNS-filteren kötjük meg. A protokoll eredményeként 200 µl térfogatú, kb. 20-30 ng/µl koncentrációjú, tiszta DNS-t kapunk.
1. ábra: DNS minıségének tesztelése a kivont DNS futtatásával, illetve PCR reakciót követıen (1. bab módszer, 2. CTAB módszer, 3. Qiagen módszer)
57
5.2
Magyarországon termesztett fı kajszifajták analízise RAPD
markerekkel A kipróbált OPA, OPB, OPC sorozatba tartozó hatvan OPERON RAPD primer közül 45 esetben kaptunk jól detektálható DNS fragmentumokat. A kapott fragmentumok többsége uniformnak bizonyult a vizsgált fajtáknál, azonban nyolc esetében reprodukálhatóan polimorf mintázatot kaptunk. A nyolc primer amplifikációja a vizsgált 16 fajtában összesen huszonhét fragmentumot eredményezett, melybıl 14 bizonyult polimorfnak. Primerenként 1-3 számú polimorf fragmentum képzıdött. A fragmentumok a 300-1700 bp mérettartományba estek. Néhány esetben egy-egy fajtára jellemzı, egyedi fragmentumot is kaptunk. Az OPC 15 1000 csak a ‘Harmatra’ volt jellemzı, míg az OPC 20 1100 csak a ‘Ceglédi Piroska’ és a ‘Harcot’ fajtákban volt fellelhetı, és az OPC 14-700 egyedül a ‘Korai Zamatos’ és ‘Harmat’ fajtáknál jelent meg (2. ábra). Az eltérı fragmentumokat felhasználva a vizsgált kajszifajták többségét sikerült egyértelmően megkülönböztetni, és egyedi DNS-ujjlenyomatot készíteni. A két magyar kajszi klón, a ‘Gönci magyar kajszi’ és ‘Magyar kajszi C.235’ esetében ugyanazt a mintázatot kaptuk. Az ún. Óriás kajszi fajtakörön (‘Szegedi mamut’, ‘Ligeti óriás’, ‘Ceglédi óriás’) belül sem tudtunk különbséget kimutatni (3. ábra).
2. ábra: Egyedi fragmentumokat produkáló OPC 14 primer, 100 bp méretmarker (Promega) mellett futtatva.
58
3. ábra: A jellemzett 16 kajszi fajta RAPD markerekkel kialakított egyedi DNS-mintázata
5.3
Magyarországon termesztett fı kajszifajták analízise SSR
markerekkel Lopes és mts. (2002) által a kajsziból elsıként izolált SSR primerek közül nyolcat választottunk ki, melybıl 5 lókuszt találtunk, amely változékonyságában kiemelkedett a többi közül. Az öt polimorf lókusz összesen 35 különbözı allélt tartalmazott a 16 vizsgált fajtánál. Az összes egyedben kimutatható 35 allél közül 8 csak egyszer fordult elı a vizsgált mintákban. Külön érdekesség, hogy három esetben a ‘Korai zamatos’ fajta, míg két lókuszban a ‘Harmat’ fajta hordozott ilyen egyedi alléleket. A megfigyelt heterozigótaság mértéke relatíve magas 0,37-0,81 között alakult, mely átlagosan 0,61 a vizsgált lókuszoknál. A több primernél a 3%-os MetaPhor agarózon történı szétválasztás olyan éles képet adott, hogy már önmagában is alkalmas volt egyes allélok kimutatására (4. ábra). A sikeres reakciótermékeket 6%-os denaturáló poliakrilamid gélen Amersham Pharmacia ALF Express szekvenáló készülékkel választottuk szét (5. ábra). A fragmentumok hosszának pontos meghatározása érdekében az amplifikált termékek mellett méretstandardot (100, 200 és 300 bp) és ismert mérető mintát futtattunk. A
59
kísérlet során felhasznált ‘Gönci magyar kajszi’ fajta alléljainak pontos méreteit a fragmentumok szekvenálását követıen mind az öt vizsgált lókusz esetében ismertük. A fajtát így belsı standardként használva lehetıségünk volt a kapott fragmentumok hosszának bázis pontosságú meghatározásra. (13. táblázat). Ezáltal eredményeink teljes biztonsággal összehasonlíthatóak az azonos primereket használó laboratóriumok kajszimarkerezési
kutatásaival.
A
felhasznált
kajszi
mikroszatellit
primerek
egyértelmően alkalmasnak bizonyultak a vizsgált fajták egyedi DNS-profiljának felállításához. A két magyar kajszi klón ‘Gönci magyar kajszi’ és ‘Magyar kajszi C.235’ esetében ugyanazt a mintázatot kaptuk. Az ún. Óriás kajszi fajtakörön (‘Szegedi mamut’, ‘Ligeti óriás’, ‘Ceglédi óriás’) belül az SSR markerek használatával sem tudtunk különbséget kimutatni.
60
4. ábra: Az amplifikátumok elızetes szétválasztása 3%-os Metaphor agaróz gélen 25 bp méretmarker (Promega) mellett (ssrPaCita19)
5. ábra: Fragmentumhossz analízis ALF szekvenátorral (ssrPaCita19)
61
13. táblázat: Az ALF szekvenátor használatával bázis pontossággal meghatározott allélek méretei az öt vizsgált lókusz esetében. Az egyedi allélek vastagon, a herozigóta lókuszok szürkével jelölve
ssrPaCITA7 ssrPaCITA23 ssrPaCITA27 ssrPaCITA19 ssrPaCITA10 Fajtanév Ceglédi bíbor Korai piros Ceglédi arany Ceglédi óriás Korai zamatos Pannónia Magyar kajszi C.235 Harcot Ligeti óriás Szegedi mamut Bergeron Gönci magyar kajszi Mandula Rózsa kajszi Ceglédi Piroska Harmat
All1
All2
All1
All2
All1
All2
All1
All2
All1
All2
187
187
140
140
261
267
114
150
157
175
187
211
140
146
249
255
114
114
175
175
187
209
140
140
249
249
114
150
149
157
187
209
140
140
261
261
114
150
157
175
193
209
140
140
249
253
112
112
157
175
187
209
140
146
259
261
150
150
175
175
187
209
138
146
261
263
114
150
175
175
189 187
209 209
136 140
138 140
261 261
261 261
114 114
150 150
157 157
165 175
187
209
140
140
261
261
114
150
157
175
209
209
138
138
261
263
150
150
175
175
187
209
138
146
261
263
114
150
175
175
187 187
187 209
148 140
148 140
261 251
261 257
114 114
150 150
175 175
175 175
187
211
142
146
251
251
114
150
157
175
187
207
146
146
261
263
108
114
155
157
62
5.4
Az ıszibarackra tervezett SSR primerkészlet alkalmasságának
vizsgálata kajszi mikroszatellit régiók variabilitásának kimutatására A felhasznált 18 ıszibarack és 1 kajszibarack mikroszatellit régióra tervezett primer közül 17 eredményezett jól azonosítható fragmentumokat. Mindösszesen két primernél nem kaptunk egyáltalán PCR terméket. Öt primernél az alkalmazott elválasztási technikával elérhetı felbontási szinten monomorf mintázatot kaptunk. Egy primert azért nem vettünk figyelembe az értékelésnél, mert kettınél több allélt (komplex mintázat) hozott létre a vizsgált genotípusoknál. Ez valószínősíthetın abból adódik, hogy az ıszibarackkal ellentétben, a kajsziban ez a lókusz nem egy, hanem két példányban van jelen (14. táblázat). 14. táblázat: A kísérletben monoform vagy értékelhetetlen eredményt adó lókuszok Lókusz
Referencia
BPPCT011
Dirlewanger és mts., 2002
Primer Várt allélMéretszármazás méret (bp) tartomány (bp) ıszibarack 172 170-180
BPPCT029
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
159
150-180
Komplex mintázat
Pchgms12
Wang és mts., 2002
ıszibarack
433
460
monomorf
Pchgms14
Wang és mts., 2002
ıszibarack
500
500
monomorf
MA006b
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
295
-
Nincs amplifikáció
MA009b
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
132
-
Nincs amplifikáció
MA010a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
122
100-130
monomorf
MA019a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
108
90-110
monomorf
MA030a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
237
230-260
monomorf
A kísérletbıl kizárás oka monomorf
A fennmaradó 10 primernél jól azonosítható polimorf fragmentumokat kaptunk olyan elrendezésben, amely megfelel az egylókuszos öröklésmenetnek (15. táblázat). A 3% MetaPhor agarózgélen történı futtatás megfelelı felbontást biztosított a fragmentumok könnyő azonosíthatóságára (6. ábra).
63
15. táblázat: A polimorf lókuszok és jellemzıik Lókusz
Referencia
Primer származás
Mérettartomány (bp)
Allél szám
Heterozi -gótaság
ıszibarack
Várt allélméret (bp) 149
BPPCT007
Dirlewanger és mts., 2002
110-180
5
0,87
BPPCT009
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
171
170-210
4
0,19
BPPCT017
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
174
190-210
3
0,54
BPPCT030
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
175
150-180
3
0,64
BPPCT037
Dirlewanger és mts., 2002
ıszibarack
155
120-150
3
0,68
Pchgms10
Wang és mts., 2002
ıszibarack
198
170-210
3
0,98
Pchgms20
Wang és mts., 2002
ıszibarack
252
250-270
2
0,33
MA013a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
211
190-220
3
0,60
MA027a
Yamamoto és mts., 2002
ıszibarack
153
120-150
4
0,31
Ac7b
Nem publikált
kajszi
-
160-200
5
0,70
6. ábra: Jól detektálható fragmentumok a 3%-os MetaPhor agaróz használatával a BPPCT007 primerrel, 100 bp méretmarker (Promega) mellett futtatva
A kísérletbe vont 45 fajtánál a 10 primer 35 polimorf allélt hozott létre, lókuszonként 2-5 allél között, mely átlagosan 3,5 polimorf allél/lókusz. A megfigyelt heterozigótaság mértéke relatíve magas, 0,19-0,98 között alakult, mely átlagosan 0,58 a vizsgált lókuszoknál. Olyan ritka allélokat is találtunk, amelyek csak néhány fajtában fordultak elı. Például az ‘Ananasznij cjurpinszkij’ és a ‘Kecs-psár’, valamint az ‘Ananasznij Cjurpinszkij’ és a ‘Korai piros’ olyan közös allélt hordoztak, amely a többi vizsgált fajtában nem fordult elı. A 10 primer használatával néhány vizsgált fajtára egyedi ujjlenyomatot is sikerült készíteni. A Reynolds-féle hasonlósági indexen (FST) alapuló UPGMA klaszteranalízissel létrehozott dendrogram a 45 fajtát két fı csoportba és néhány alcsoportba sorolta. A két fı csoportot (I. és II.) többségében ázsiai és nem ázsiai eredető fajták alkotják. A nem
64
ázsiai eredető fajták további alcsoportokra oszthatók. A legnagyobb, és jól körülhatárolható alcsoport (I.a) kilenc, a magyar kajszi fajtakörbe tartozó, magyar és a környezı országokból származó fajtákat tartalmazott. A másik nagy alcsoport (I.b) az Óriás kajszi fajtakörbe tartozó fajtákon kívül néhány ceglédi fajtát tartalmazott (7. ábra).
7. ábra: 45 kajszifajta UPGMA analízissel készített dendrogramja 9 ıszibarack és 1 kajszi SSR primerekkel végzett vizsgálat alapján
65
5.5
Kajszi genomokra tervezett SSR régiók variabilitásának
elemzése egy széles genetikai bázisú kajszifajta csoporton Százharminc kajszifajta és három rokon faj genetikai polimorfizmusát vizsgáltuk 10 kajszi genomi DNS alapján tervezett SSR-primer segítségével (16. táblázat). Az összes vizsgált lókusz polimorf volt. Az allélok méretét kapilláris elektroforézissel mőködı
automata
szekvenálókészülék
használatával
bázispár
pontossággal
meghatároztuk (8. ábra). A vizsgált lókuszok közül a legnagyobb polimorfizmust az UDAp-407 lókusz esetében tapasztaltuk, ahol 22 allélt azonosítottunk. Az effektív allélszám is itt volt a legnagyobb (17. táblázat). Ezzel szemben a legkevésbé polimorfnak (7 allél) az ssrPaCITA27 lókusz bizonyult. Mindent összevetve 133 minta tesztelésével 133 allélt azonosítottunk, ami átlagosan 13,3 allél/lókusz értéket mutatott (17. táblázat). A lókuszonként megfigyelt heterozigótaság mértéke Ho=0,8636 (UDAp410 lókusz) és Ho=0,3182 (ssrPaCITA27) között változott; az átlag 0,6281 volt (17. táblázat). A megfigyelt heterozigótaság (Ho) minden fajta esetében kisebb volt az elméletileg várt heterozigótaságnál (He). 16. táblázat: A vizsgált mikroszatellit primerek jellemzıi Lókusz
Annealing (ºC)
Ismétlıdés típus
Referencia
ssrPaCITA7
Mérettartomány (bp) 186-224
60
(AG)n
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA10
142-212
58
(CT)n
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA19
98-148
60
(TC)n
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA23
112-157
56
(AC)n (AG)n
Lopes és mts., 2002
ssrPaCITA27
224-266
58
(TC)n (TA)n (TG)n
Lopes és mts., 2002
UDAp-407
118-162
58
(TC)n TT (TC)n
Messina és mts., 2004
UDAp-410
116-146
58
(AG)n
Messina és mts., 2004
UDAp-414
150-214
58
(AG)n
Messina és mts., 2004
UDAp-415
139-143
58
(GA)n
Messina és mts., 2004
UDAp-420
154-261
58
(CT)n
Messina és mts., 2004
Az összes egyedben kimutatható 133 különbözı allél közül 32 olyan allélt találtunk, amely csak egyszer fordult elı a vizsgált mintákban. Az egyedi allélokat az eltérı ökoföldrajzi csoportokból származó fajtákban vagy rokonfajokban találtuk meg (18. táblázat). Nem amplifikálódó (null-allélokat) 5 fajta három lókuszában találtunk:
66
‘Zard’ (ssrPaCITA 27 lókusz), ‘Uzsgorod’ és ‘Rakovice’ (ssrPaCITA 23 lókusz) és a ‘Korai kecskemétiben’ (osztrák szelekció) (UDAp-410). Az FST értékek 0,4544 (ssrPaCITA 7) és 0,7363 (ssrPaCITA 27) között változtak 0,5786-as átlaggal. Az FSTbıl becsült Nm génáramlás mértéke az ssrPaCITA 7 lókuszban 0,3003 volt, ami háromszor magasabb érték, mint az ssrPaCITA 27 lókuszban mért 0,0895 (17. táblázat).
17. táblázat: 10 SSR lókusz jellemzıi a 133 vizsgált fajta alapján Lókusz
ssrPaCITA7 ssrPaCITA10 ssrPaCITA19 ssrPaCITA23 ssrPaCITA27 UDAp-407 UDAp-410 UDAp-414 UDAp-415 UDAp-420 Átlag Szórás:
Megfigyelt Elméletileg várt Kimutatott Effektív allélek allélszám heterozigótaság heterozigótaság (H0) (He) száma (Ne) 14 17 12 11 7 22 12 14 11 13 13,3 4
4,2511 3,4492 3,9001 4,2604 2,4551 6,4712 4,6933 5,0867 3,2244 3,1568 4,0948 1,1461
0,8346 0,5038 0,7519 0,6031 0,3182 0,6917 0,8636 0,4887 0,6242 0,6015 0,6281 0,1666
0,7677 0,7128 0,7464 0,7682 0,5949 0,8447 0,7899 0,8064 0,6925 0,6858 0,7413 0,0725
Wright-féle beltenyésztési koefficiens (FST) 0,4544 0,6453 0,4944 0,6154 0,7363 0,5909 0,4576 0,6958 0,5477 0,5598 0,5768 -
Génáramlás (Nm) 0,3002 0,1374 0,2556 0,1562 0,0859 0,1731 0,2963 0,1093 0,2056 0,1966 0,1834 -
18. táblázat: Az egyedi alléleket hordozó fajták
Lókusz ssrPaCITA10 ssrPaCITA19 ssrPaCITA23 ssrPaCITA27 ssrPaaCITA7 UDAp-407 UDAp-415 UDAp-410 UDAp-414 UDAp-420
Fajta Arvam aramat, Effekt, Karim Abad 8, Hunza 1, Vesna Vesna Kijevskij aromatnij, Harcot Poldij junskij Priana Effekt, Jerevan, Kuresia, Junskij, Poldij junszkij, Priusadenbnij Ananasznij ciurpinszkij, Kecs-psar Gulkin Gulkin, Morden-604, Paszinok Ceglédi kedves, Mari de Cenad, Zaposzdolje
67
8. ábra: A kapilláris elektroforézissel végzett fragmentumhossz analízis lehetıvé tette az allélok bp pontosságú azonosítását
68
5.5.1 A fajták közötti genetikai kapcsolatok vizsgálata A kajszifajták genetikai rokonságának megállapításához egy dendrogramot szerkesztettünk. A dendrogramot a 10 SSR-lókusz adatai alapján összeállított genetikai távolságmátrixból páronkénti genetikai távolságok alapján UPGMA módszerrel készítettük. A dendrogram a fajtákat két nagy csoportra osztotta (10. ábra). Az 1-es csoportban két alcsoport (1.1 és 1.2) található, amelyek a legtöbb közép-európai fajtát magukba foglalják. Az 1.1 alcsoport 6 európai fajtát és az amerikai ‘Goldrich’-ot tartalmazza. Az 1.2 alcsoportba került a legtöbb európai fajta. Ezen a csoporton belül további 4 kelet-európai alcsoport jelenik meg: a Magyar kajszi fajtacsoport; az Óriás kajszi fajtacsoport; a román nemesítési programból származó hibridek; a Rózsabarack típusú fajták és ceglédi hibridek. Külön kiemeltük a ‘Salah’ ismert vagy feltételezett pedigréjő hibridjeit (10. ábra és 6. táblázat). Az alcsoportokba tartozó fajták kapcsolatát alátámasztják részben morfológiai jellemzıik, részben pedig az ismert pedigrék. Az 1. csoport többi, különbözı ökoföldrajzi területekrıl származó fajtái az 1.3 csoportba kerültek. A 2. csoport csak közép-ázsiai eredető fajtákat tartalmaz.
5.5.2 Ökoföldrajzi csoportok és a rokon fajok közötti genetikai kapcsolat Az allélgyakoriságok alapján kiszámítottuk az öt ökoföldrajzi csoport genetikai távolságát és genetikai azonosságát (Nei, 1972). Az eredményeket a 19. táblázatban mutatjuk be. A legkisebb mértékő genetikai azonosságot (43%) a közép-ázsiai és a nyugat-európai csoportok között állapítottuk meg. Ezzel szemben a kelet-európai, a nyugat-európai és az iráni-kaukázusi csoportok genetikailag nagyon hasonlónak bizonyultak, az azonossági index 79 és 81% közötti értékeket vett fel. A genetikai távolságokon alapuló UPGMA dendrogram két fı csoport elkülönítését eredményezte (10. ábra). Az egyik tartalmazza a közép-ázsiai csoportot, míg a másik két további alcsoportra oszlik. Az egyik alcsoport a nyugat-európai és az észak-amerikai, míg a másik az iráni-kaukázusi és a kelet-európai fajtákat foglalja magába.
69
9. ábra: A különbözı eredető kajszi fajtacsoportok és a három rokonfaj genetikai távolságai alapján (Nei, 1972) szerkesztett UPGMA dendrogram
A 9. ábra a P. armeniaca termesztett fajtái és a rokon fajok közötti genetikai kapcsolatot szemlélteti. A P. x dasycarpa, P. brigantiaca (syn: P. brigantina) és Plumcot távol esnek a közös kajszicsoporttól. A rokonfajok közül P. brigantiaca mutatja a legkisebb azonosságot a P. armeniaca termesztett fajtáival. A P. x dasycarpa, amely egy kajszi x P. cerasifera természetes hibrid átmenetinek bizonyult a kajszifajták csoportjai és a Plumcot között. Ez utóbbi a kajszi és a P. salicina mesterséges hibridje. A genetikai azonosság a P. brigantiaca és a kajszicsoportok között általában kismértékő volt (19. táblázat). A P. brigantiaca és a közép-ázsiai, valamint az észak-amerikai csoportok közötti genetikai azonosság értéke nem haladta meg a 10%-ot. 19. táblázat: Genetikai azonosság és különbség az 5 kajszi ökoföldrajzi csoport és a 3 rokonfaj között Nyugateurópai Nyugat-európai Észak-amerikai Közép-ázsiai Iráni-kaukázusi Kelet-európai P. × dasycarpa Plumcot P. brigantiaca
0,2674 0,8231 0,4146 0,2254 0,4852 0,7517 1,8503
Északamerikai 0,7653 0,6749 0,4800 0,4292 0,6930 1,2254 2,3240
Közép IrániKeletP. × Plumcot P. -ázsiai kaukázusi európai dasycarpa brigantiaca 0,4391 0,6606 0,7982 0,6156 0,4716 0,1572 0,5092 0,6188 0,6510 0,5001 0,2936 0,0979 0,5712 0,4568 0,2362 0,2148 0,0967 0,5601 0,8239 0,3738 0,4252 0,1595 0,7834 0,1937 0,4653 0,5664 0,2206 1,4430 0,9839 0,7651 0,2224 0,1112 1,5380 0,8552 0,5685 1,534 0,2143 2,3365 1,8360 1,5115 2,1965 1,5404 -
70
10. ábra: 133 kajszifajta közötti genetikai távolság alapján szerkesztett UPGMA dendrogram
71
6
EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA
6.1
DNS-kivonási eljárás adaptálása kajszira A tiszta, ép és jó minıségő DNS-izolálása szinte minden növénygenetikai
vizsgálat alapját képezi, hiszen számos olyan anyagot tartalmazhat a növényi szövet, ami akadályozhatja a DNS vizsgálatát. Ez különösen igaz a legtöbb magasabb rendő növényfajra, ahol poliszaharidok, polifenolok, különbözı pigmentek, illetve egyéb másodlagos anyagcseretermékek alkalmatlanná tehetik a DNS felhasználását (Wen és Deng, 2002). A másodlagos anyagcseretermékek, amelyek a gyümölcsfák szinte minden szövetében gazdagon jelen vannak, a klasszikus extrakciós eljárásokkal nehezen tisztíthatók (Qiang és mts., 2004). Munkánk során az elsı lépés a DNS-izoláláshoz legmegfelelıbb növényanyag kiválasztása volt. A különbözı idıpontokban győjtött levelek tesztelése során, azt tapasztaltuk, hogy a tavaszi rügypattanás után szedett minták feldolgozása adta a legjobb DNS-minıséget, hiszen ekkor a levélszövet még kevésbé tartalmaz polifenolokat, ami a munkafolyamatot jelentısen megnehezíti. Ezt a megállapítást több szerzı is megerısítette a fás- és lágyszárú növények DNS-extrakciós eljárásainak tökéletesítése során (Porebski és mts., 1997; Li és mts. 2002). A –80 fokon hosszabb ideig tárolt leveleket is alkalmasnak találtuk, azonban jobb minıségő és nagyobb mennyiségő DNS-t kaptunk, ha a mintákat a szedést követıen egybıl feldolgoztuk. A kutatás idején fellelhetı DNS-kivonási eljárásokat több szempontból is megvizsgáltuk. Az eredmény szempontjából legfontosabb kritérium a nyert DNS PCR reakcióhoz való alkalmassága volt. Ezen kívül olyan módszert kerestünk, amely alkalmas nagy mintaszám gyors és rutinszerő feldolgozására, és minél kevesebb környezetre,
valamint
egészségre
káros
vegyszer
használatával,
egyszerően
kivitelezhetı. A kutatás kezdetekor elsıként kipróbált eljárás az (amerikai) bab módszer volt (M2. melléklet). Az inkubációs idık növelésével, illetve az alkoholos kicsapási mőveletek többszöri ismétlésével lehetett a módszer hatékonyságát leginkább növelni. Az eljárást eredetileg bab növényre dolgozták ki, és nem a kajszi durvább szövető, a DNS-izolálást jelentısen megnehezítı anyagokat nagy mennyiségben tartalmazó levelére. Ebbıl adódóan többszöri ismétlésekkel lehetett csak a kívánt eredményt elérni. A plusz lépések bevezetése azonban még tovább növelte az amúgy is hosszú mővelet
72
idejét. Noha sikerült jó minıségő DNS-t nyernünk, a módszert idıigényessége és nehézkessége miatt a továbbiakban nem alkalmaztuk. A következı módszer, amit vizsgáltunk, egy fás növények körére kidolgozott CTAB alapú eljárás volt (M2. melléklet) (Cheng és mts., 1997). A kísérlet során kezdetben rossz minıségő, töredezett DNS-t kaptunk, amely alkalmatlan volt a PCR reakcióhoz. A módszer optimalizálása során lecsökkentettük a centrifugálás sebességét, alacsonyabb inkubációs hımérsékletet alkalmaztunk, illetve általában megpróbáltuk csökkenteni azoknak a lépéseknek a számát, ahol a DNS durva fizikai hatásnak van kitéve (rázás, ütögetés stb.). Sikerült így egy gyors, olcsó, rutinszerően elvégezhetı eljáráshoz jutnunk, ahol a DNS minısége is kielégítı. A módszer hátrányát a kivitelezéséhez használt nagy mennyiségő egészségre káros vegyszer használata jelentette. Az extrakciós pufferhez használt CTAB por alakban légzıszervi megbetegedést idézhet elı. A DNS további tisztításához használt kloroform az idegrendszert károsító anyag, a fenol pedig rákkeltı hatású. Ezért megpróbáltunk olyan módszert találni, amely hasonló hatékonyságú, de emellett kevésbé veszélyes a felhasználóra és a környezetünkre nézve. A késıbbi vizsgálataink során rátaláltunk a Qiagen cég által kifejlesztett DNeasy Plant Mini Kitre (M2. melléklet). Az SSR markerekkel végzett kutatásokhoz szinte kizárólag ezt a technikát alkalmaztuk a DNS izolálásához. Ez a módszer egy teljesen zárt rendszer, a használt oldatok biztonságosak, az eljárás rövid idı alatt könnyen elsajátítható. Amellett, hogy egészségi szempontból semmiféle veszéllyel nem jár, lehetıvé teszi, hogy megfelelı minıségő és mennyiségő genomi DNS-hez jussunk munkánk során. A módszer egyedüli hátrányát a szükséges vegyszerek és eszközök magas költsége jelenti, de ezt teljes mértékben kompenzálják az említett elınyös tulajdonságai.
73
6.2
A Magyarországon legnagyobb területen termesztett fajták
azonosítása és egyedi DNS-ujjlenyomat készítése RAPD és SSR markerekkel 6.2.1 Jellemzés RAPD markerekkel Az Operon cég által szintetizált RAPD primereket széles körben és nagy hatékonysággal használják a Prunus genotípusok jellemzésére. A nemzetségen belül az egyes sorozatok eltérı hatékonysággal mőködtek. İszbarackban leginkább az E, M (Raddova és mts., 2003), cseresznyében a B, G (Lisek és mts., 2006), mandulában a M, S (Resta és mts., 1998), míg kajsziban a B, C primer sorozatok (Hurtado és mts., 1999) eredményezték a legnagyobb polimorfizmust. Az alapos tesztelést követıen kiválasztott nyolc primer amplifikációja a vizsgált 16 fajtában összesen huszonhét fragmentumot eredményezett, melybıl 14 (53%) volt polimorf. A polimorf fragmentumok aránya megegyezik a Hurtado és mts. (1999) által korábban közöltekkel, akik 18 kajszifajta vizsgálatakor 22 RAPD marker felhasználásával 45 polimorf markert azonosítottak. Több olyan markert is találtunk, amely csak egy vagy két fajtában fordult elı, OPC 15 1000 csak a ‘Harmatra’ volt jellemzı, míg az OPC 20 1100 csak a ‘Ceglédi Piroska’ és a ‘Harcot’ fajtákban volt fellelhetı. A két fajta származása ismert, de nem található a szülık között közös fajta. A jelenségre esetleg az adhat magyarázatot, hogy a legtöbb észak-amerikai fajta európai genetikai alapokra vezethetı vissza. Az OPC 14-700 egyedül a Kertészeti Egyetem Növénynemesítés Tanszéke által nemesített ‘Korai Zamatos’ és ‘Harmat’ fajtákon jelent meg. Annak ellenére, hogy a két fajta egyik szülıje sem azonos, több hasonló tulajdonsággal rendelkeznek (korai érés, önmeddıség), valamint a szülınövények az örmény fajtakör tagjai közül kerülhettek ki, ami magyarázatot adhat a közös fragmentumra. A polimorf fragmentumokat felhasználva a vizsgált kajszifajták többségét sikerült egyértelmően megkülönböztetni, és egyedi DNS ujjlenyomatot készíteni. A két magyar kajszi klón ‘Gönci magyar kajszi’ és ‘Magyar kajszi C.235’ esetében ugyanazt a mintázatot kaptuk. Vélhetıen azért, mert a klónok közti genetikai különbség olyan csekély, hogy a RAPD markerek nem alkalmasak az elkülönítésükre. Az úgynevezett Óriás kajszi fajtakörön (‘Szegedi mamut’, ‘Ligeti óriás’, ‘Ceglédi óriás’) belül sem tudtunk különbséget tenni. Ez alátámasztja azt a mostanában kialakult feltételezést, hogy a ‘Szegedi mamut’ és a ‘Ceglédi óriás’ fajtakeveredés
74
következményeként tulajdonképpen ugyanaz a fajta, és szinonim elnevezésnek tekinthetı. A ‘Ligeti óriás’ és a ‘Ceglédi óriás’ fajták között pedig nincsenek morfológiai különbségek, csak néhány pomológia eltérés (pl. érésidı), így vélhetıen a genetikai állományukat tekintve is nagyon hasonlóak (Mády és Szalay, 2003). A vizsgálat alapján elmondható, hogy a viszonylag kevés RAPD primer felhasználásával sikerült a fajtákat megkülönböztetni egymástól. Ennek alapján a RAPD markerek alkalmasak lehetnek nemcsak tudományos célokra, hanem a kereskedelmi tételek azonosítására, illetve fajtaelismerési célokra egyaránt (Hurtado és mts., 1999). Ez irányú törekvésünket bizonyítja, hogy a vizsgálati eredményeinket, mint a hazánkban termesztett fajták meghatározására alkalmas módszert, az Országos Mezıgazdasági Minısítı Intézet Kertészeti Szaporítóanyagok Osztálya egy szerzıdés keretében fajtaazonosítási célra használja tovább. A szerzıdés értelmében az OMMI részére bocsátottuk a munka teljes irodalmi hátterét, ami e tárgykörbıl korábban megjelent publikációk összességét, illetve a fentiekben közölt, a konkrét vizsgálatra kidolgozott módszer leírását jelenti. Ezek ismeretében a munka rutinszerően végezhetı, illetve az irodalmi háttér ismeretében késıbbi, esetlegesen felmerülı problémák is korrigálhatók. A reakció igen érzékeny a környezeti feltételekre (vegyszer, eszközök, laborkörülmények). Ezért közöltük az általunk felhasznált vegyszerek pontos listáját (termék neve, gyártó, gyártási szám) és az összes laboratóriumi eszközt, felszerelést, amely tételek beszerzése a vizsgálat elvégzését sikeressé teszi. A megbízó laboratóriumában beprogramoztuk a PCR-készüléket az általunk e vizsgálatra kidolgozott programmal. A kísérletet a kajszifajták DNS-ének kivonásától az eredmények
detektálásáig,
a
laborszemélyzet
jelenlétében
többször
sikeresen
megismételtük. A kísérletek elvégzését követıen ígéretesnek tőnt, hogy a fajtaelismerés során, a DUS vizsgálatok elvégzésekor szerepet kapnak majd a molekuláris markerek is. A megfelelı referenciagyőjtemények fenntartása rendkívül költséges feladat. Kézenfekvı és költséghatékony megoldás lenne ezeket a győjteményeket legalább részben molekuláris markerekkel leváltani. Eddig konkrét elırelépés nem történt a területen. A fajtaelismerési metodikák ma még kizárólag morfológiai markerekere épülnek. A
75
fajtaregisztrációs költségek csökkentése azonban egyre nagyobb kényszer, ezért a közeljövıben várható, hogy elkezdıdik a molekuláris markerek használata is. Ez a munka Magyarországon több éven keresztül egyedülálló törekvést jelentett a molekuláris gyümölcsnemesítés és a nemesítési alapanyagok körültekintı, genetikai kapcsolatokat feltáró értékelése felé. Noha a RAPD markerekkel végzett vizsgálatok az utóbbi idıben háttérbe szorultak, és más technikák is elérhetıvé váltak, nem tőnt el végérvényesen. Építve a korábbi évek tapasztalataira, és megismerve a módszer korlátait ma leginkább kis egyedszámú fajtacsoportok, valamint egyes kapcsolt tulajdonságok jellemzésére használják elsısorban a Prunus nemzetségben (Raddova és mts., 2003; Lisek és mts., 2006). Ezekben az esetekben a RAPD markerek olcsó, gyors és a célnak megfelelı megoldást jelentenek.
6.2.2 Jellemzés SSR markerekkel A primer szekvenciák publikálása elıtt nekünk volt elıször lehetıségünk kajszifajtákból izolált mikroszatellit markereket alkalmazni. Kézenfekvınek tőnt a választás, hogy a korábban már RAPD markeres jellemzésnek alávetett fajtacsoporttal kezdjük az új primerek tesztelését. Az eredmények messze felülmúlták a korábbi publikációkon alapuló várakozásainkat. Az elért, átlagosan 7 allél/lókusz érték jóval magasabb, mint a korábban publikált lókuszonként 3-4 allél szám (Badenes és mts., 2002; Hormaza 2002). Egyedül Zebentyayeva és mts., (2004) értek el hasonló polimorfizmust, de jóval több - 74 féle, genetikai hátterét tekintve igen eltérı-genotípus felhasználásával. A legtöbb egyedi allélt, szám szerint ötöt, a Kertészeti Egyetem Növénynemesítési Tanszéke által nemesített ‘Korai Zamatos’ és ‘Harmat’ fajták hordozták. Ez az eredmény nem meglepı, hiszen ezek az új nemesítéső anyagok genetikai hátterüket és egyes tulajdonságaikat (pl. érésidı) tekintve jelentısen eltérnek a hazánkban termesztett honos, több évtizede termesztésben lévı fajtáktól. A mikroszatellit markerek alkalmazásával kapott eredményeink egyértelmően alátámasztották a korábban RAPD markerek által nyert eredményeinket. A morfológiai és RAPD markerekkel történı kutatások alapján felállított hipotézis, miszerint a ‘Szegedi mamut’, ‘Ceglédi óriás’, és ‘Ligeti óriás’ fajták azonos genetikai háttérrel rendelkeznek, az általunk vizsgált mikroszatellit lókuszok esetében is megerısítést
76
nyert, mivel a kapott allélok mind az öt vizsgált lókusz esetében azonosak voltak. Emellett a ‘Gönci magyar kajszi’ és ‘Magyar kajszi C.235’ fajta klónok között sem találtunk különbséget.
6.3
İszibarack SSR primerek használata 45 kajszigenotípus
jellemzésére 6.3.1 A felhasznált primerek alkalmassága és a polimorfizmus jellemzıi A
különbözı
Prunus
fajok
mikroszatellit
régióit
határoló
szekvenciák
konzervativizmusa lehetıvé tette számunkra, hogy ıszibarack primereket használjunk a kajszi genetikai sokféleségének tanulmányozására (Tautz, 1989; Bell és Ecker, 1994; Guilford és mts., 1997; Sosinski és mts., 2000). Már az elsı ıszibarack genomi DNS-re kidolgozott SSR-markerekrıl is bebizonyosodott, hogy néhány más Prunus faj esetében is felhasználhatók (Cipriani és mts., 1999; Sosinski és mts., 2000; Testolin és mts., 2000; Aranzana és mts., 2002; Hormaza, 2002; Dirlewanger és mts., 2002). A fenti közlemények közül csak Hormaza (2002) számolt be kajszifajták vizsgálatáról. A tapasztalatokat fel tudtuk használni a kajszi genetikai variabilitásának tanulmányozására ıszibarackra tervezett primerek (Dirlewanger és mts., 2002; Wang és mts., 2002; Yamamoto és mts., 2002) alkalmazásával. Fontos megjegyezni, hogy a kiválasztott primerek közül korábban csak négyet használtak kajszifajták genetikai analíziséhez. A felhasznált ıszibarack primerek 90%-ban alkalmasak voltak mikroszatellit lókuszok azonosításra, mely jól bizonyítja a módszer alkalmazhatóságát. Ez még akkor is igaz, ha egy részüknél monomorf mintázatot kaptunk. Ennek alapján az is megállapítható, hogy nem feltétlenül szükséges minden Prunus fajra külön mikroszatellit markereket kifejleszteni, ami igen idıigényes és költséges folyamat. Az átlagos polimorfizmus mértéke 3,5 allél/lókusz volt, hasonló a Badenes és mts. (2002) 3,1, Sánchez-Pérez és mts. (2005) 3,9, valamint Hormaza (2002) 4,1 kajszi mikroszatellit markerekkel végzett vizsgálataihoz azonban lényegesen alacsonyabb Zebentyayeva és mts., (2003) által elért eredménynél, ahol ugyanez a mérték 7,6 volt. Az amplifikációs fragmentumok hossza hasonló tartományba esett, mint az ıszibarackban található azonos mikroszatellitek. A 19 primerbıl mindösszesen négyet próbáltak ki kajsziban. A kapott fragmentumhosszak ezekben az esetekben is
77
megegyeztek a korábban már publikált kísérletekkel (Zhebentyayeva és mts., 2003; Sánchez-Pérez és mts., 2005). A lókuszonkénti nagy allélszám (3,5) megerısítette, hogy a mikroszatellit markerek nagyon hasznos eszközei a kajszi fajtaazonosításának. Az allélszám nagyobb, mint az egyéb molekuláris markerekkel végzett korábbi vizsgálatoknál, mint az izoenzimek (Badenes és mts., 1996), RFLP (de Vicente és mts., 1998) vagy akár a Hurtado és mts. (1999) RAPD kísérlete, ahol az átlagos lókuszonkénti allélszám csak kettı volt.
6.3.2 A vizsgált fajták genetikai kapcsolatának elemzése A kapott DNS-ujjlenyomat és dendrogram a felhasznált elválasztási technika alacsony felbontó képessége miatt távolról sem teljes. Ennek ellenére számos érdekes megállapítás tehetı. A magyar kajszi fajtacsoport számos különbözı módon elnevezett fajtákat tartalmaz. A fajták egy része Magyarországon jól ismert árufajta és tájfajta. Ezenkívül számos szomszédos ország rendelkezik olyan fajtával, amit magyar kajsziként ismernek és termesztenek. A fajták egy része nem tudatos nemesítıi munka eredménye, ezért a származásuk sem pontosan ismert. Mivel nem sikerült különbséget találni a fajták között, megerısítést nyert az elızetes feltételezésünk, hogy hasonló a genetikai hátterük. A csoporthoz egyik legközelebb található fajta a ‘Bergeron’. Ez a megfigyelés megeggyezik Hormaza (2002) SSR markerekkel végzett kísérletének eredményével, melyben a ‘Gönci magyar kajszit’ a ‘Bergeront’ is tartalmazó francia fajtacsoportban helyezte el. Az Óriás kajszi fajtacsoportba tartozó három fajta a ‘Ceglédi óriás’, a ‘Ligeti óriás’ és a ‘Szegedi mamut’ nagyon hasonló pomológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, de korábban különbözı genotípusonként tartották ıket számon. A RAPD és SSR markerekkel végzett kutatások azzal az eredménnyel zárultak, hogy a három fajtának valószínőleg azonos a genetikai háttere. A kísérletben felhasznált ıszibarack mikroszatellit primerekkel sem sikerült különbséget tenni a vizsgált óriás kajszik között.
78
6.3.3 A felhasznált elválasztási technika jellemzıi A MetaPhor agarózzal történı gélelektroforézis alkalmas a mikroszatellitek azonosítására. Összehasonlítva a poliakrilamid gélen történı futtatással, vagy pedig az automata fragmentumhossz analízissel, messze a legegyszerőbb és legolcsóbb módszer. Különösen jó felbontás érhetı el a 100-200 bp mérettartományban. Az egyik legnagyobb elınye a módszernek, hogy könnyen adaptálható olyan gyakorlati területekre, mint például a faiskolák, illetve kertészeti árudák, ahol a fajtaazonos szaporítóanyag kulcskérdés. A módszer használata semmiképpen sem egyedi, a szakirodalmi adatok alapján a vizsgálati cél és a lehetıség dönti el, hogy az egyes esetekben melyik módszert alkalmazták (20. táblázat) Az természetesen nyilvánvaló, hogy egy automata detektációs rendszer, mely alkalmas az egyes fragmentumok hosszának akár egynukleotid eltérését is jelezni, nagyobb allél variabilitást képes kimutatni, mint az agaróz gél. Következésképpen az allélok száma várhatóan magasabb lett volna annál, mint amit a jelen eredmények mutatnak. Egy magasabb felbontóképességő rendszerben az a 6 primer, amely monomorf mintázatot mutatott, lehet, hogy polimorf fragmentumokat eredményezett volna, mely segítségével a vizsgált fajták még pontosabban elkülöníthetık lettek volna.
79
20. táblázat: Mikroszatellit lókuszok detektálására alkalmazott módszerek a Prunus nemzetségben Poliakrilamid gél Aranzana és mts., 2002; Georgi és mts., 2002; Sosinski és mts., 2000; Testolin és mts., 2000 Cipriani és mts., 1999; Dirlewanger és mts., 2002; Bliss és mts., 2002; Martínez-Gómez és mts., 2003a
Metaphor ® agaróz Cipriani és mts., 1999; Dettori és mts., 2001; Martínez-Gómez és mts., 2003a
Mandula
Joobeur és mts., 2000; Bliss és mts., 2002; Martínez-Gómez és mts., 2003
Martínez-Gómez és mts., 2003a
Kajszi
Zhebentyayeva és mts., 2003
Hormaza, 2002; Sánchez-Pérez és mts., 2005; Romero és mts., 2006; Ruthner és mts., 2006
Fajok İszibarack
Hurtado és mts., 2002b; Vilanova és mts., 2003; Decroocq és mts., 2003 Cseresznye/ meggy
Downey és Lezzoni, 2000; Aranzana és mts., 2002; Schueler és mts., 2003 Cantini és mts., 2001; Dirlewanger és mts., 2002; Struss és mts., 2003
Cipriani és mts., 1999 Egyéb Prunus fajok Decroocq és mts., 2003; Martínez-Gómez és mts., 2003b
6.4
ABI® szekvenátor Aranzana és mts., 2003a; Wang és mts., 2002; Yamamoto és mts., 2002; Etienne és mts., 2002
Decroocq és mts., 2003, Zhebentyayeva és mts 2004; Maghuly és mts., 2006
Wünsch és Hormaza, 2002a
Serrano és mts., 2002; Martínez-Gómez és mts., 2003b
Kajszi SSR markerekkel vizsgált 136 genotípus azonosítása és
genetikai kapcsolatuk, származásuk elemzése 6.4.1 A felhasznált primerek alkalmassága és a polimorfizmus jellemzıi Mint ahogyan az elızı vizsgálatból is kiderült, a mikroszatellitek evolúciósan rögzült szekvenciák, ezért az egy fajból fejlesztett primerek hatékonyak lehetnek más rokon, de akár nem rokon fajtákban is. A Prunus nemzetségben fıként az elsıként kifejlesztett ıszibarack primerek használata volt a jellemzı. Az a felvetés is hamar napvilágot látott, hogy a nagyobb genetikai távolság rendszerint csökkenti a primerek amplifikációs képességét, valamint a polimorfizmus mértékét. A nagyobb genetikai távolsággal fokozatosan rövidül a mikroszatellitek hossza is (Steinkellner és mts., 1997; Hormaza, 2002). Továbbá a „null” allélok gyakorisága is megnövekszik, köszönhetıen annak, hogy a primerek hibás bekötıdésre való hajlandósága egyre nagyobb (Ciofi és mts., 1998).
80
A kutatás eredményei bizonyítják, hogy a nagy polimorfizmussal bíró homológ mikroszatellit markerek kiváló eszközei a kajszi fajtaazonosítás célú vizsgálatainak. Az átlagos lókuszonkénti allélszám 13,3 volt, amely lényegesen nagyobb mint a 4,1 érék, amit Hormaza (2002) talált 48 fajtás 19 polimorf SSR markerrel végzett vizsgálatában, 7,64, amit Zebentyayeva és mts. (2003) azonosított 74 genotípus és 14 markerrel, vagy 3,1, amirıl Romero és mts. (2003) számoltak be, amikor 40 kajszifajtát jellemeztek 16 mikroszatellit markerrel. Az összes korábbi tanulmányban azonban a kajszifajták diverzitásának megállapításához ıszibarackból izolált és tervezett SSR primereket használtak. A vizsgálatunkban elért magas lókuszonkénti allélszám elsısorban annak volt köszönhetı, hogy a korábbiaknál jóval több genotípust vizsgálunk, valamint elıször használtuk tíz - részben Ruthner és mts. (2003) által már elızetesen tesztelt kajsziból izolált SSR primert (Lopes és mts., 2002; Messina és mts., 2004). A vizsgálatokban megfigyelt 10 lókusz átlagos heterozigótasága Ho=0,6281 volt, ami magasabb, mint a Zhebentyayeva és mts. (2003) és Romero és mts. (2006) által ıszibarack primerekkel megállapított értékek (az elıbbi esetben 0,517, az utóbbi vizsgálatnál 0,320). A nagy allélszám és a nagy heterozigótaság különösen alkalmassá teszi az SSR-markereket a genotípusok egyedi genetikai profiljainak leírására. Az FSTértéket a populációgenetikában a heterozigótaság (variabilitás) részpopulációkban és egész populációban való eloszlásarányának kifejezésére használják. Wright-nak megfelelıen a 0,25 fölötti FST-értékek nagyon nagy genetikai differenciálódást mutatnak (Hartl és Clark, 1997). Mivel az általunk vizsgált mintákban az FST-értékek átlaga 0,5768 (17. táblázat) volt, megállapítható, hogy a fajták között relatíve nagy a genetikai különbözıség. A vizsgálatainkban megállapított magas FST-értékek a fajták közötti nagy variabilitásra utalnak, amelynek kialakulása a kismértékő génáramlással magyarázható. Erre utalnak a 17. táblázatban bemutatott Nm értékek is. Az vizsgált lókuszok átlagos génáramlási (Nm) értéke 0,1834 volt, ami rendkívül kis érték. Ha az Nm <1 értéket vesz fel már kis génáramlásról beszélhetünk. A legtöbb gyümölcstermı növény különbözik a vadontermı ısétıl, ahol a keresztbeporzást az önmeddıség fenntartja. A gyümölcsfáknál a domesztikáció általában azt jelenti, hogy megváltoztatjuk a szaporodási mechanizmust, a generatív szaporodást igyekszünk a vegetatív úton történı szaporítással leváltani. Míg KözépÁzsiában a fajták háziasítása természetes környezetben, a természetes populációban
81
folyt, és lehetıség volt vad és „félvad” típusok folyamatos interakciójára, addig Európában, a vegetatív szaporítás bevezetése, és néhány fajtára szőkített nemesítési alapanyag használata, jelentısen szőkítette a fajták genetikai variabilitását. KözépÁzsiában a kajszi természetes élıhelyén, ahol ez még evolúciós elıny, a fajták zömmel önmeddıek, míg az európai fajták többsége öntermékenyülı, megfelelıen az árutermesztési céloknak. Az öntermékenyülés a vegetatív szaporítás mellett tovább csökkentette a fajták genetikai variabilitását. Az ivaros úton szaporodó fajok populációinak jellemzésére használt mutatók, a vegetatív szaporítású termesztett gyümölcsfajták értékelésére csak korlátozott mértékben használhatók fel. Ugyanakkor nem tekinthetünk el attól, hogy a jelenlegi fajtacsoportok magukban hordozzák a természetes ısi populációkra jellemzı, kimutatható és bizonyos mértékben módosuló allélvariabilitást. Ezek az eredmények a részben fixált genotípusú fajták egymás közötti különbözıségének fokára utalnak, és nem adnak információt – az itt nehezen értelmezhetı – egész populációra nézve.
6.4.2 A kajszi genetikai változékonysága és fajták közötti genetikai kapcsolatok Az UPGMA klaszterelemzés alapján készült dendrogram számos csoportot hozott létre, amelyek összefüggésben vannak az ezeket alkotó fajták pedigréjével, illetve a genotípusok földrajzi eredetével. A vizsgált európai fajták legtöbbje az 1.2 alcsoportba tartozik. Közép- és Kelet-Európában – elsısorban a Kárpát-medencében – elterjedt egy sor nagy gyümölcső és édes magvú fajta, amely az öntermékenyülı Magyar kajszi fajtacsoporthoz tartozik. A nemesítés során ezeknek a fajtáknak számos hibridjét is létrehozták. Az egy csoportba tartozó klónok különbözı elnevezései – legalább néhány esetben – valószínőleg szinonimák. A mikroszatellit régiók variabilitásának adatai alapján megállapítható, hogy feltételezéseink szerint 18 ebbe a csoportba tartozó fajta közül 15 szoros rokonságban van, és közülük 5 (‘Albena’, ‘Andornaktályai magyar kajszi’, ‘Crvena ugarska’, ‘Gönci magyar kajszi’ és ‘Nagygyümölcső magyar kajszi’) esetben az eltérı elnevezések mögött azonos genotípus jelenléte is lehetséges (10. ábra). Három fajta (‘Mari de Cenad’, ‘Szilisztrenka kompotna’ és ‘Vesna’) klasztere igen messze esett a csoport többi tagjától, ami talán abból adódott, hogy mind a három
82
esetben hibridekrıl van szó, illetve a begyőjtés során ejtett hibát sem lehet teljes mértékben kizárni. Világosan elkülönül a magyar óriás kajszifajták csoportja. Az ide tartozó ‘Ceglédi óriás,’ ‘Szegedi mamut’ és ‘Ligeti óriás’ fajták teljes azonosságot mutatnak. A korábbi RAPD illetve ıszibarack SSR-el végzett elemzés is azonos eredménnyel zárult e fajták esetében (Pedryc és mts., 2002; Ruthner és mts., 2003; Ruthner és mts., 2006). A ‘Ceglédi óriás’ és a ‘Szegedi mamut’ szinonim elnevezések. A ‘Ligeti óriás’ viszont kevés pomológiai bélyegben (pl. érésidı) különbözik a ‘Ceglédi óriástól’ (Mády és Szalay, 2003). A ceglédi nemesítéső fajták jellegzetes klasztert alkotnak. Mind a három vizsgált fajta pedigréjében szerepel a ‘Ceglédi óriás’, de ennek ellenére viszonylag távol esnek ettıl a fajtától. Feltőnı viszont a Rózsabarackokhoz való közelség. A ‘Ceglédi arany’ (‘Rózsabarack C.1668’ × ‘Ceglédi óriás’) esetében ez a fajta eredetével magyarázható, de ez lehet a magyarázat a ‘Ceglédi kedves’ esetében is, amely a ’Ceglédi óriás’ szabad megporzásából jött létre (Mady és Szalay, 2003). A bukaresti Agronómiai Kutató Intézet nemesítési programjából származó ‘Comandor’, ‘Sirena’, ‘Litoral’, ‘Selena’ és ‘Sulmona’ fajták az ‘Umberto’, ’Ananas’ és ‘Luizet’ fajták keresztezésébıl jöttek létre, és ennek megfelelıen a dendrogramon mind egy klaszterbe kerültek. Érdekes módon a francia ‘Luizet’ fajta a ‘Magyar kajszi’ fajtacsoporttal egy klaszterbe került. A ‘Magyar kajszi’ feltételezett helyérıl a ‘Luizet’ pedigréjében már korábbi közleményekbıl is tudomást lehetett szerezni (Faust és mts., 1998; Hormaza, 2002). A tanulmányunkban az SSR-variabilitás alapján kimutatott fajtakapcsolatokat korábbi erre vonatkozó információk is megerısítették. A Hormaza (2002) által közölt dendrogramon a ‘Bergeron’, ‘Gönci magyar kajszi’ és ‘Luizet’ szorosan egymás mellett foglaltak helyet, egy klaszterben. Geuna és mts. (2003) az AFLP-markerekkel kapott eredményei szerint a ‘Budapest’, ‘Bergeron’, ‘Ananas’, ‘Comandor’, ‘Selena’, ‘Ceglédi óriás’, ‘Ceglédi bíbor’ és ‘Magyar kajszi’ fajták szintén egy klaszterbe kerültek. A Bergeron RAPD és ıszibarack SSR primerekkel végzett elemzések során is következetesen a Magyar kajszi fajtacsoporthoz közeli besorolást kapott (Pedryc és mts., 2002; Ruthner és mts., 2003; Ruthner és mts., 2006). A kecskeméti csoport két alklasztert alkotott, az elkülönülés alapja egyértelmően az érési idı volt korai és kései kecskeméti fajták szerint.
83
A ‘Klosterneuburger’ kajszi egy alsó-ausztriai helyi fajta, aminek feltehetıen magyar az eredete. A vita, hogy talán azonos a Magyar kajszi valamelyik klónjával, már a múlt évszázadban megkezdıdött. A gyümölcsöt elsı alkalommal 1898-ban a bécsi, majd 1901-ben a kremsi kajszikiállításon sorolták be, mint ‘Hungarian Best’ fajtát. Az 1943-as bécsi és kremsi kiállításon azonban a két fajtát már elkülönítették (Lösching és Passecker, 1954). Adataink világosan mutatják, hogy két külön fajtáról van szó. Ettıl némiképp eltérı eredményre jutottak Regner és mts. (2004), akik számos ‘Klosterneuburger’ és ‘Ungarishe Beste’ fajtát és klónjaikat jellemezték. A vizsgálat azt az eredményt hozta, hogy a két fajta, noha termesztési tulajdonságaiban némileg különbözı, genetikai hátterét tekintve lényegében azonosnak tekinthetı. Mindkét fajta tartalmaz azonban olyan genotípusokat, amelyek eltérnek az alaptípusoktól. Ez részben a vegetatív szaporítással tovább vitt mutációk eredménye. Ezenkívül azonban voltak olyan genotípusok is, amelyek genetikailag olyan távoliak az alaptípusoktól, hogy a fajtához tartozásuk megkérdıjelezhetı, az elnevezés tévesnek tekinthetı. A ‘Vinschger Marille’ és az ‘Annanasznij cjurpinszkij’ egy klaszterbe kerültek. Közös genetikai hátterük nem kizárt. Az 1.1 és az 1.3 alcsoportok a nyugat- és kelet-európai, valamint a legtöbb északamerikai fajtát magukba foglalják. A ‘Harcot’, ‘Veecot’, ‘Bahrt’ (Orange red) és ‘Morden-604’ fajták közép-ázsiai fajtákkal közös helye az 1.3 alcsoportban bizonyítéka annak, hogy a legtöbb amerikai fajta amellett, hogy európai genetikai alapokra vezethetı vissza, ázsiai eredető génekkel is gazdagodott. Ezek az eredmények megegyeznek azzal a feltevéssel, hogy a kajszifajták Kínából kerültek Örményországba, majd a rómaiak (ie. 70–60) közvetítésével Görögországon és Olaszországon át kerültek Európába (White, 1970). A kajszi egyes fajtái az USA-ba az angol telepesek és a spanyol misszionáriusok révén kerültek be Európából és részben Ázsiából (Faust és mts., 1998; Hagen és mts., 2002; Mehlenbacher és mts., 1991). Hagen és mts. (2002) arról számoltak be, hogy az észak-amerikai ‘Veecot’ fajta genetikai rokonságot mutat egy török fajtával, míg Geuna és mts. (2003) szerint a ‘Veecot’ – más észak-amerikai fajtákkal együtt – a ‘Jerevani’ (szin.: ‘Salah’) fajtával van rokonságban. A mi vizsgálataink azt mutatták, hogy a ‘Veecot’ három másik Észak Amerikai fajta (‘Bhart’ ‘Orange red’ és ‘Kuresia’) társaságában a nyugat-európai fajtákhoz közel a ‘Jereváni’val egy csoportban található.
84
A 2. klaszter a különbözı allélok nagy változatosságával csak az ázsiai genotípusokat (pakisztáni magoncok) tartalmazta. Ez a csoport kitőnı példa arra, hogy a ma termesztett fajták elıdeinek természetes populációi mennyire voltak képesek fenntartani nagyfokú variabilitásukat. Ennek egyik legfontosabb eszköze az a bonyolult genetikai rendszer, amely biztosítja az allogámiát, és ennek köszönhetıen gátolja az egyes allélok fixálódását homozigóta állapotban, illetve ezek kiszorulását a populáció génállományából. A vizsgálatban felhasznált pakisztáni magoncok egy ilyen populáció képviselıi, amely egyrészt megtartotta egyedi voltát, és emiatt vált el a többi klasztertıl, de ugyanakkor a populáción belüli variabilitás nem engedte, hogy a populációból kiemelt viszonylag kisszámú minta alapján elváljanak egymástól az alklaszterek szintjén (Zohary és Hopf, 1994). Ázsia legtöbb területén a kajszi domesztikációja a természetes magoncok révén történt meg, ami lehetıvé tette a faj jelentıs genetikai diverzitásának megtartását. Ezzel szemben Európában a termesztési célra leginkább megfelelı klónokat szelektálták, és vegetatív szaporítás útján tartották fenn (Hagen és mts., 2002; Zhebentyayeva és mts., 2003). Ez a gyakorlat óhatatlanul jelentıs génerózióhoz vezetett, amit nagyon jól példáz a magyar fajtakörben tapasztalt korlátozott variabilitás. A vegetatív szaporítás mellett a kialakult öntermékenyülés is csökkenti a variabilitást A 9. ábrának megfelelıen a jól ismert eredető, közép-ázsiai ‘Zard’ fajta közel áll a ‘Zaposzdolje’ fajtához, aminek földrajzi eredetérıl nem rendelkezünk semmilyen hiteles információval. Elemzésünk azonban megerısíti az ázsiai allélok jelenlétét a ‘Zaposzdolje’ fajtában. A fajta származását illetıen érdekes megállapítást tettek Halász és mts. (2007) a kajszi S-allél rendszerének vizsgálata során. Az Sc-RN-áz szekvencia alapján a ‘Zaposzdolje’ fajta a mediterrán fajtákhoz volt közelebb. Erre magyarázatot adhat, hogy Ukrajna az ázsiai és nyugat-európai fajták találkozó helyét jelentette a XVII. században. Az Sc-RN-ázok közötti hasonlóság és egyben a fajták közötti nagy genetikai távolság azzal magyarázható, hogy a ‘Zaposzdolje’ keleti és nyugati fajták leszármazottja, de különbözı genetikai összetétellel.
85
6.4.3 A kajszi és néhány rokon faj genetikai kapcsolatának elemzése klaszteranalízissel A rokon fajokkal való összehasonlításban a közönséges kajszi, P. armeniaca termesztett fajtái egy klaszterbe tartoznak, egyértelmően jelezve a közös genetikai hátteret. Ettıl a csoporttól a P. brigantiaca áll a legtávolabb (15. ábra). Ez a faj számos morfológiai jegyben jelentısen különbözik a P. armeniaca-tól, amit a molekuláris elemzések többször is alátámasztottak. Takeda és mts. (1998) és Hagen és mts. (2002) RAPD- és AFLP-markerek alkalmazásával az Armeniaca szekción belül, a P. brigantiaca-t helyezte el a legtávolabb a P. armeniaca-tól. A P. ×dasycarpa és a Plumcot, a P. armeniaca × P. cerasifera és a P. armeniaca × P. salicina hibridjei. Ezek a fajok a 9. ábra szerint is a P. brigantiaca és más kajszi fajok között helyezhetık el a genetikai különbség alapján. Ezeknek a fajoknak a P. brigantiaca-hoz és P. armeniacahoz való viszonyát Takeda és mts. (1998), valamint Hagen és mts. (2002) szintén megerısítették.
6.4.4 Ökoföldrajzi csoportok közötti genetikai viszony A kajszifajták hagyományos taxonómiája a fiziológiai és morfológiai bélyegek összehasonlításán alapul, és négy fı ökoföldrajzi csoportot tart számon (Kosztina, 1969). Ezek közül hármat elemezhettünk: a magyar, a nyugat-európai és az északamerikai fajtákat magában foglaló európai csoportot, az iráni-kaukázusi csoportot, és a közép-ázsiai csoportot. A 9. ábra szemlélteti az UPGMA klaszteranalízis alapján megállapított genetikai viszonyokat a csoportok között. A számításokban nem vettük figyelembe a csoportok közötti keresztezésekbıl nyert hibrideket. A nyugat-európai és észak-amerikai fajták klasztereinek közvetlen kapcsolata megfelelt annak a korábbi feltételezésnek, hogy az amerikai fajták az európai fajtacsoportnak közvetlen leszármazottai (Kosztina, 1969; Bailey, és Hough, 1975; Badenes és mts., 1996; Romero és mts., 2003; Pedryc és mts., 2009). Természetesen az is lehetséges, hogy véletlenül éppen olyan kilenc észak-amerikai fajtát sikerült kiválasztanunk, amely európai fajtákból származik. Ez egyértelmően magyarázza, hogy miért van olyan közel ez a csoport a nyugat-európai fajtákhoz. Az európai fajtacsoporton belüli további alcsoportok definiálása nem egyszerő, már a csoporton belüli keresztezés lehetısége miatt sem. Ennek ellenére egyes szerzık
86
kiemelik a kelet-európai fajtacsoportot, mint az európai fajták egy jellegzetes típusát (Kosztina, 1969; Kovalev, 1970). Romero és mts. (2003) által ıszibarack SSR markeres vizsgálat adatai alapján elvégzett klaszteranalízis a kelet-európai csoportot képviselı magyar fajtákat közelebb helyezte el az ázsiai fajtákhoz, mint a nyugat-európai fajták csoportjához. Az eredményeink is alátámasztották az elıbbi megállapításokat azzal, hogy az iráni-kaukázusi és a kelet-európai fajták csoportja ebben az esetben is közeli kapcsoltságra utaló két alcsoportot alkotnak. Ezek az eredmények a kajszi ázsiai géncentruma irányából való terjeszkedés mentén a magyar eredető fajtakört egy közbülsı állomás szerepébe helyezik. A vándorlás során fellépı, a faj genomját modifikáló folyamatok fontosságát korábban már hangsúlyozta Crossa-Raynaud (1960) és Faust és mts. (1998).
A molekuláris markerek használata a fajták, nemesítési anyagok genetikai hátterének megállapítására és nemesítési célú hasznosítására, a fajtagyőjtemények kezelése és rendszerezése szempontjából egy ígéretes eszköz a gyümölcsfajtákkal foglalkozó szakemberek számára. A legtöbb gyümölcsfajta vegetatív úton szaporított, és a szelekciós folyamatok csak kis számú nemzedékre korlátozódnak (Hormaza, 2002). A kajsziban fontos nemesítési célok elérése - mint a szélesebb ökológiai adaptáció, a kórokozókkal, kártevıkkel szembeni rezisztenia, az új, a korábbinál jobb minıségő gyümölcstípusok iránti igény - csak különbözı ökoföldrajzi csoportokból származó fajták felhasználásával lehetséges (Audergon, 1995; Badenes és mts., 1998; Egea és mts. 1995). A vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a mikroszatellitek a fajtaazonosításban kiválóan alkalmazható kodomináns markerek, melyek nagy sikerrel használhatók a nemesítési programokban akár a szinonim nevő fajták és hibridek elkülönítésére is.
87
7 •
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK Azonosítottunk olyan RAPD és SSR markereket, amelyek alkalmasak voltak a Magyarországon legnagyobb területen termesztett 16 fajta azonosítására, egyedi DNS-profiljának elkészítésére. A módszert az OMMI a gyakorlatban felhasználta fajtaazonosítási célokra.
•
Megállapítottuk, hogy a kajszibarack genomjára tervezett SSR-primerkészletek hatékonysága a kajszi mikroszatellit variabilitásának kimutatására jelentısen nagyobb, mint az egész Prunus nemzetségben alkalmazható ıszibarack primereké.
•
Eredményeink alapján megállapítható, hogy összehasonlítva a kínai, közép-ázsiai, iráni-kaukázusi, kelet-európai, nyugat-európai és észak-amerikai fajtacsoportok közötti genetikai távolságokat, illetve egyedi és közös allélok jelenlétét, a fıleg magyar kajszifajtákra épülı közép-európai kajszifajtacsoport az iráni-kaukázusi fajtákkal mutatja a legnagyobb genetikai azonosságot. Megerısítést nyert a francia ‘Bergeron’
és
‘Luizet’
fajták
genetikai
kapcsolata
a
magyar
fajtákkal.
Megállapítottuk, hogy az Óriás kajszi fajtacsoportba tartozó három fajta genetikai háttere vélhetıen azonos. Bebizonyítottuk, hogy az észak-amerikai fajták keletkezésében úgy az európai, mint az ázsiai génállományok szerepet játszottak. A közép-európai fajtákon kívül minden csoportban felfedeztünk egyedi allélokat. A legtöbb egyedi SSR-allél a kínai és közép-ázsiai fajtákban található. A kínai fajták SSR-polimorfizmusa jelentısen eltér a többi csoport fajtáitól. •
Vizsgálataink rávilágítottak arra, hogy az alapvetıen magyar fajtákból álló középeurópai fajtakörben mért genetikai diverzitás egyértelmően alacsonyabb volt, mint az összes többi fajtacsoportnál.
88
8
ÖSSZEFOGLALÁS A kutatómunka során talán hazánkban az egyik legnagyobb termesztési
hagyománnyal rendelkezı csonthéjas gyümölcsnek, a kajszinak a genetikai hátterét vizsgáltuk DNS-alapú molekuláris markerekkel.
Elsıként több módszer összehasonlításával olyan DNS-izolálási technikát kellett találnunk, ami több követelménynek is eleget tesz. A kutatás idején fellelhetı DNS kivonási eljárásokat több szempontból is megvizsgáltuk. A nyert DNS PCR reakcióhoz való alkalmasságán kívül, olyan módszert kerestünk, amely alkalmas nagy mintaszám gyors és rutinszerő feldolgozására, és minél kevesebb környezetre, valamint egészségre káros vegyszer használatával egyszerően kivitelezhetı. A választásunk a Qiagen cég által kifejlesztett DNeasy Plant Mini Kitre esett. A módszer egy teljesen zárt rendszer, a használt oldatok biztonságosak, az eljárás rövid idı alatt könnyen elsajátítható. Amellett, hogy egészségi szempontból semmiféle veszéllyel nem jár, lehetıvé teszi, hogy megfelelı minıségő és mennyiségő genomi DNS-hez jussunk munkánk során. A konkrét markerezési munka a kilencvenes évek végén elérhetı RAPD markerek alkalmazásával kezdıdött. A vizsgálatba állami elismerésben részesített, a nemzeti leíró fajtajegyzékben szereplı összesen 16, Magyarországon legnagyobb területen termesztett fajtát vontunk be. A kipróbált hatvan OPERON RAPD primer közül 45 esetben kaptunk jól detektálható DNS-fragmentumokat. A kapott fragmentumok többsége uniformnak bizonyult a vizsgált fajtáknál, nyolc esetében azonban reprodukálhatóan polimorf mintázatot kaptunk. A polimorf fragmentumokat felhasználva a vizsgált kajszifajták többségét sikerült egyértelmően megkülönböztetni, és egyedi DNS-ujjlenyomatot készíteni. Elıször sikerült az Óriás kajszi fajtakörbe tartozó fajták genetikai hátterét illetıen információhoz jutni, és igazolni azt a feltételezést, hogy a fajták genetikai állományukat tekintve nagyon hasonlók. A vizsgálati eredményeinket, mint a hazánkban termesztett fajták meghatározására alkalmas módszert, az Országos Mezıgazdasági Minısítı Intézet Kertészeti Szaporítóanyagok Osztálya egy szerzıdés keretében átvette. A RAPD kísérlet eredményeit késıbb elsıként általunk használt kajsziból izolált SSR markerekkel is megerısítettük.
89
A
különbözı
Prunus
fajok
mikroszatellit
régióit
határoló
szekvenciák
konzervativizmusa lehetıvé tette számunkra, hogy ıszibarack primereket használjunk a kajszi genetikai sokféleségének tanulmányozására. A kísérletbe negyvenöt olyan kajszifajtát állítottunk, melyeket Közép-Európában termeszthetıség szempontjából értékesnek találtuk. A felhasznált 17 ıszibarack primer 90%-ban alkalmas volt mikroszatellit lókuszok azonosítására, ami jól bizonyítja a módszer alkalmazhatóságát. A klaszter analízissel létrehozott dendrogram a 45 fajtát két fı csoportba és néhány alcsoportba sorolta. A két fı csoportot fıként ázsiai és nem ázsiai eredető fajták alkották.
A legszélesebb körő kutatást 133 kajszi genotípus, a P. x dasycarpa és P. brigantiaca fajok, valamint egy interspecifikus hibrid bevonásával végeztük. A fajták jellemzésére két különbözı forrásból származó, 10 kajszira tervezett mikroszatellit primert alkalmaztunk A kísérletbe vont fajták megfelelıen reprezentálták az Európában, az iráni-kaukázusi régióban, Közép-Ázsiában és Észak-Amerikában termesztett különbözı származású kajszikat. Megállapítottuk, hogy a kajszibarack genomjára tervezett SSR-primerkészletek hatékonysága a kajszi mikroszatellit variabilitásának kimutatására jelentısen nagyobb, mint az egész Prunus nemzetségben alkalmazható ıszibarack primereké. Eredményeink alapján megállapítható, hogy összehasonlítva a közép-ázsiai, iránikaukázusi, kelet-európai, nyugat-európai és észak-amerikai fajtacsoportok közötti genetikai távolságokat, illetve az egyedi és közös allélok jelenlétét, a fıleg magyar kajszi fajtákra épülı közép-európai kajszi fajtacsoport az iráni-kaukázusi fajtákkal mutatja a legnagyobb genetikai azonosságot. Megerısítést nyert a francia ‘Bergeron’ és ‘Luizet’ fajták genetikai kapcsolata a magyar fajtákkal. Bebizonyítottuk, hogy az északamerikai fajták keletkezésében úgy az európai, mint az ázsiai génállományok szerepet játszottak. A közép-európai fajtákon kívül minden csoportban felfedeztünk egyedi allélokat. A legtöbb egyedi SSR-allél a kínai és közép ázsiai fajtákban található. Vizsgálataink rávilágítottak arra is, hogy az alapvetıen magyar fajtákból álló középeurópai fajtakörben mért genetikai diverzitás egyértelmően kisebb volt, mint az összes többi fajtacsoportnál.
90
9
SUMMARY Among the Prunus species, probably apricot cultivation has the biggest tradition
in Hungary. In our study, we examined the genetic background of this important species with DNA-based molecular markers. As the first step of our work, we compared several DNA isolation techniques in order to find an appropriate method that fulfils certain criteria. Our aim was to find a method wich apart from enabling us to extract high quality DNA was also suitable for PCR reactions to process a large number of samples without being harmful to human health and natural environment. Finally, we chose the DNeasy Plant Mini Kit produced by Qiagen. This method can be performed in a totally closed system, the solutions used are safe, and it can easily process a large number of samples and means no threat to the users and the environment.
RAPD markers were the first molecular markers that were available for us in the late 90’s. From the National Catalogue we selected the 16 most widely cultivated apricot cultivars in Hungary. Sixty decamer primers from Operon Technologies were used for the PCR reaction. Forty-five of the 60 primers tested were able to produce well detectable fragments but only 8 of them amplified highly reproducible polymorphic patterns. We managed to differentiate among almost all of the varieties. In the case of three varieties, which belong to the so-called Óriás group, we found similar patterns. These results confirm our preliminary expectation that these three varieties have almost the same genetic background therefore it is impossible to reveal these slight differences by using RAPD markers. Based on an agreement the National Quality Control Authority has the intention to use our elaborated method for variety identification purposes. The above-mentioned results were confirmed later with SSR markers isolated from apricot.
91
The possibility of cross species amplification among different Prunus species using SSR primers allowed us to use primers developed in peach to study genetic diversity in apricot. 45 apricot accessions were selected that represent the cultivars grown in Central Europe. From the 17 peach primers tested, 90% was able to amplify SSRs in apricot and more than a half of them were polymorphic. The dendrogram generated from the UPGMA cluster analysis classified the 45 cultivars into two major groups and several subgroups. The two major groups contain cultivars with mainly Asian and non-Asian origin
In our most comprehensive study, 133 apricot accessions, 1 species (P. brigantiaca) and 2 hybrids (P. x dasycarpa, Plumcot) were chosen to represent the European, Irano-Caucasian, Central Asian and North American cultivars with different origin. Ten different primer combinations originally developed for apricot SSR loci and representing different regions of the apricot genome were used for amplification. The results obtained in this study show that highly polymorphic homologous apricot microsatellite markers could be effectively used for fingerprinting purposes in apricot. They were proven to be more effective than the usage of heterologous peach primers which are extensively used for cross-amplification in stone fruits. Our results clearly demonstrated that comparing the genetic distances and the presence of unique and shared alleles of the Irano-Caucasian, Eastern European, Western European, Central Asian and North American cultivars, the Central European group - containing mainly Hungarian cultivars - and the Irano-Caucasian group showed the highest genetic identity. We confirmed the genetic relatedness of two French cultivars Bergeron and Luizet to the Hungarian cultivars. We managed to prove that both European and Asian gene pools were vital in the origin of North American cultivars. We identified unique alleles in every group except the Central-European cultivar group. The Central Asian group contained the highest number of unique alleles. Our results revealed that genetic diversity was the lowest in the Central-European group including mainly Hungarian cultivars.
92
10
MELLÉKLET
M1. Irodalomjegyzék 1.
Abbott, A.G., Lecouls, A.C., Wang, Y., Georgi, L., Scorza, R., Reighard, G. (2002) Peach: The model genome for Rosaceae genomics. Acta Horticulturae, 592: 199-209.
2.
Abbott, A.G., Rajapakse, S., Sosinski, B., Lu, Z.X., Sossey-Alaoui, K., Gannavarapu, M., Scorza, R., Reighard, G., Ballard, R.E., Callahan, A., Baird, W.V. (1998) Construction of saturated linkage maps of peach crosses segregating for characters controlling fruit quality, tree architecture and pest resistance. Acta Horticulturae, 465: 141-150.
3.
Adam-Blondon, A.F., Sevignac, M., Bannerot, H., Dron, M. (1994) SCAR, RAPD and RFLP markers linked to a dominant gene (Are) conferring resistance to anthracnose in common bean. Theoretical and Applied Genetics, 88: 865–870.
4.
Adams, W.T. (1983) Application of isozymes in tree breeding. In: Tanksley, S.D., Orton, T.J. (Eds.): Isozymes in plant genetics and breeding. Elsevier, Amsterdam, pp. 381-400.
5.
Agarwal, M., Shrivastava, N., Padh, H. (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in Plant Science. Plant Cell Reports, 27: 617– 631.
6.
Ahmad, R., Potter, D., Southwick, S.M. (2004) Identification and characterization of plum and pluot cultivars by microsatellite markers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 1: 164-169.
7.
Akkaya, M.S., Bhagwat, A.A., Cregan, P.B. (1992) Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics, 132: 1131-1139.
8.
Amirbakhtiara, N., Kiania, S., Mohammadia, Sh., Sayed-Tabatabaeib, B.E., Moradic, H. (2007) Molecular characterization and genetic relationship among almond cultivars assessed by RAPD and SSR markers. Scientia Horticulturae, 111: 280-292. Aranzana, M.J., Arús, P., Carbó, J., King, G.J. (2001a) AFLP and SSR markers for genetic diversity analysis and cultivar identification in peach (Prunus persica (L) Batsch). Acta Horticulturae, 546: 367–370.
9.
10.
Aranzana, M.J., de Vicente, M.C. and Arús, P. (2001b) Comparison of fruit and leaf DNA extracts for AFLP and SSR analysis in peach (Prunus persica (L.) Batsch). Acta Horticulturae, 546: 297-300.
11.
Aranzana, M.J., Garcia-Mas, J., Carbo, J., Arus, P. (2002) Development and variability of microsatellite markers in peach. Plant Breeding, 121: 87–92.
12.
Aranzana, M. J., Carbo, J., Arus, P. (2003a) Using amplified fragment-length polymorphisms (AFLPs) to identify peach cultivars. Journal of the American Society For Horticultural Science, 128: 672-677.
93
13.
Aranzana, M.J., Carbó, J., Arús, P. (2003b) Microsatellite variability in peach [Prunus persica (L.) Batsch]: cultivar identification, marker mutation, pedigree inferences and population structure. Theoretical and Applied Genetics, 106: 1341-1352.
14.
Arnold, M.L., Bruckner, C.M. Robinson, J.J. (1991). Pollen mediated introgression and hybrid speciation in irises. The Proceedings of the National Academy of Sciences. U.S.A, 88: 1398-1402.
15.
Arulsekar, S., Parfitt, D.E., and Kester, D.E. (1986) Comparison of isozyme variability in peach and almond cultivars. Journal of Heredity, 77: 272-274.
16.
Arús, P., Ballester, J., Jauregui, B., Joobeur, T., Truco, M.J., de Vicente, M.C. (1999) The European Prunus mapping project: update of marker development in almond. Acta Horticulturae, 484: 331-336.
17.
Audergon, J.M. (1995) Variety and Breeding. Acta Horticulturae 384: 35-45.
18.
Badenes, M.L., Asins, M.J., Carbonell, E.A., Llácer, G. (1996) Genetic diversity in apricot, Prunus armeniaca, aimed at improving resistance to plum pox virus. Plant Breeding, 115: 133–139.
19.
Badenes, M.L., Cuenca, J., Romero, C., Martinez, J., Llácer, G. (2002) Description of peach cultivars from Spain. Identification of closely related clones by SSR markers. Acta Horticulturae, 592: 211-216.
20.
Badenes, M.L., Hurtado, M.A., Sanz, F., Archelos, D.M., Burgos, L., Egea, J., Yacer, G. (2000) Searching for molecular markers linked to male sterility and self-compatibility in apricot. Plant Breeding, 119: 157-160.
21.
Badenes, M.L., Martínez-Calvo, J., Llácer, G. (1998) Analysis of apricot germplasm from the European eco-geographical group. Euphytica, 102: 93–99.
22.
Bailey, C.H., Hough, L.F. (1975) Apricot. Advances in fruit breeding. Pardue Univ. Press, West Lafayette, Indiana. pp. 367–383.
23.
Ballester, J., Socias i Company, R., Arús, P., de Vicente, M.C. (2001) Genetic mapping of a major gene delaying blooming time in almond. Plant Breeding, 120: 268-270.
24.
Baránek, M., Raddova, J., Pidra, M. (2006) Comparative analysis of genetic diversity in Prunus L. as revealed by RAPD and SSR markers. Scientia horticulturae, 108(3): 253-259.
25.
Bartolozzi, F., Warburton, M.L., Arulsekar, S., Gradziel, T.M. (1998) Genetic characterization and relatedness among California almond cultivars and breeding lines detected by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Journal of the American Horticultural Science, 123: 381-387.
26.
Battistini, S., Sansavini, S. (1991) Electrophoretic analysis of isozyme variability in apricot cultivars. Journal of Genetics and Breeding, 45: 117–122.
27.
Beranek, M., Raddova, J., Miroslav, P. (2006) Comparative analysis of genetic diversity in Prunus L. as revealed by RAPD and SSR markers. Scientia horticulturae, 108: 253-259.
94
28.
Bell, C.J., Ecker, J.R. (1994) Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics, 19: 137-144.
29.
Bianchi Valmor, J., Fachinello, J.C ; Venturi, S., Tartarini, S., Sansavini, S. (2002) Molecular AFLP and SSR markers resolutive for genetic identification of plum cultivars (Amplified Frament Length Polymorphism - Single Sequence Repeats - Prunus domestica L - Prunus salicina Lindl. - Prunus cerasifera Ehrb). Rivista di Frutticoltura. 64: 83-87.
30.
Blenda, A.V., Reighard, G.L., Baird, W.V., Georgi, L.L., Abbott, A.G. (2002) Molecular markers and candidate resistance genes: a genetic study of tolerance to ring nematode in peach. www.intl-pag.org. Plant, Animal & Microbe Genomes X Conference. San Diego, USA.
31.
Bliss, F.A., Arulsekar, S., Foolad, M.R., Becerra, V., Gillen, A., Warburton, M.L., Dandekar, A.M., Kocsisne, G.M., Mydin., K.K. (2002) An expanded genetic linkage map of Prunus based on an interspecific cross between almond and peach. Genome, 45: 520-529.
32.
Boonprakob, U., Byrne, D. H., Graham, C. J., Okie, W. R., Beckman, T., Smith, B. R. (2001) Genetic relationships among cultivated diploid plums and their progenitors as determined by RAPD markers. Journal of the American Society for Horticultural Science, 4: 451-461.
33.
Boritzki, N.I., Plieske, J., Struss, D. (2000) Cultivar identification in sweet cherry (Prunus avium L.) using AFLP and microsatellite markers. Acta Horticulturae, 538: 505-510.
34.
Bošković, R., Tobutt, K.R., Nicoll, J.F. (1997) Inheritance of isoenzymes and their linkage relationships in two interspecific cherry progenies. Euphytica 93: 129-143.
35.
Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., Davis, R.W. (1980) Construction of genetic linkage map in man using restriction length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 32: 314-331.
36.
Bouhadida, M., Casas, A.M., Moreno, M.A., Gogorcena, Y. (2007) Molecular characterization of Miraflores peach variety and relatives using SSRs. Scientia Horticulturae, 111: 140-145.
37.
Brock, T.D., Freeze, H. (1969) Thermus aquaticus gen.n. and sp. N., a nonsporulating extreme thermophile. Journal of Bacteriology, 98. 289-297.
38.
Brózik, S., Nyéki, J. (1975) A kajszi termékenyülési viszonyai. In: Brózik, S., Nyéki, J. (Szerk.): Gyümölcstermı növények termékenyülése. Mezıgazdasági Kiadó, Budapest, pp. 173-176.
39.
Burgos, L., Berenguer, T., Egea, J. (1993) Self- and cross-compatibility among apricot cultivars. HortScience, 28: 148-150.
40.
Byrne, D.H. (1989) Electrophoretic variability in four diploid stone fruits. Acta Horticulturae, 254: 29-33.
41.
Byrne, D.H., Littleton, T.G. (1988) Verification of the parentage of presumed peach × almond hybrids by isozyme analyses. Fruit Varieties Journal, 42: 130134.
95
42.
Byrne, D.H., Littleton, T.G. (1989a) Characterization of isozyme variability in apricots. Journal of the American Society for Horticultural Science, 114: 674678.
43.
Byrne, D.H., Littleton, T.G. (1989b) Interspecific hybrid verification of plum × apricot hybrids via isozyme analyses. HortScience, 24: 132-134.
44.
Cantini, C., Iezzoni, A.F., Lamboy, W.F., Boritzki, M., Struss, D. (2001) DNA fingerprinting of tetraploid cherry germplasm using simple sequence repeats. Journal of the American Society for Horticultural Science, 126: 205-209.
45.
Casas, A.M., Igartua, E., Balaguer, G., Moreno, M.A. (1999) Genetic diversity of Prunus rootstocks analyzed by RAPD markers. Euphytica, 110: 139-149.
46.
Chaparro, J.X., Werner, D.J., O’Malley, D., Sederoff, R.R. (1994) Targeted mapping and linkage analysis of morphological isozyme, and RAPD markers in peach. Theoretical and Applied Genetics, 87: 805-815.
47.
Cheng, F.S., Brown, S.K., Weeden, N.F. (1997) A DNA extraction protocol from various tissues in woody species. HortScience, 32: 806-835.
48.
Ciofi, C., Funk, S.M., Coote, T., Cheesman, D., Hammond, R.L., Saccheri, I.J., Bruford, M.W. (1998) In: Karp, A., Isaac, P.G., Ingram, D.S. (Eds.) Molecular tools for screening biodiversity. Chapman and Hall, London, pp. 413-417.
49.
Cipriani G., Lot G., Huang W.G., Marrazzo M.T., Peterlunger E., Testolin R. (1999) AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach (Prunus persica (L) Batsch): Isolation, characterisation and cross-species amplification in Prunus. Theoretical and Applied Genetics, 99: 65-72.
50.
Clarke, J.B., Ortega, E., Sutherland, B., Marchese, A., Tobutt, K.R. (2004) Some new cherry microsatellites and their transferability to other stone fruits. Acta Horticulturae, 663: 83-86.
51.
Clarke, J.B., Tobutt, K.R. (2003) Development and characterization of polymorphic microsatellites from Prunus avium 'Napoleon'. Molecular Ecology Notes, 4: 578-580.
52.
Claverie, M., Bosselut, N., Lecouls, A. C., Voisin, R, Lafargue, B., Poizat, C., Kleinhentz, M., Laigret, F., Dirlewanger, E., Esmenjaud, D. (2004) Location of independent root-knot nematode resistance genes in plum and peach. Theoretical and Applied Genetics, 4: 765-773.
53.
Crossa-Raynaud (1960) Problems d‘arboriculture fruitiere en Tunise. Abricotiers. Ann. L‘Institut National de la Recherche Agronomique de Tunisie, 33: 39–63.
54.
Decroocq, V., Favé, M.G., Hagen, L., Bordenave, L., Decroocq, S. (2003) Development and transferability of apricot and grape EST microsatellite markers across taxa. Theoretical and Applied Genetics, 106: 912-22.
55.
Decroocq, V., Hagen, L.S., Fave, M.G., Eyquard, J.P., Pierronnet, A. (2004) Microsatellite markers in the hexaploid Prunus domestica species and parentage lineage of three European plum cultivars using nuclear and chloroplast simplesequence repeats. Molecular Breeding 13: 135-142.
96
56.
Dettori, M.T., Quarta, R., Verde, I. (2001) A peach linkage map integrating RFLPs, SSRs, RAPDs, and morphological markers. Genome, 44: 783-790.
57.
De Vicente, M.C., Truco, M.J., Egea, J., Burgos L., Arús, P. (1998) RFLP variability in apricot (Prunus armeniaca L.). Plant Breeding, 117: 153-158.
58.
Dirlewanger, E., Cosson, P., Tavaud, M., Aranzana, M.J., Poizat, C., Zanetto, A., Arús, P., Laigret, F. (2002) Development of microsatellite markers in peach [Prunus persica (L.) Batsch] and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry (Prunus avium L.). Theoretical and Applied Genetics, 105: 127–138.
59.
Dirlewanger, E., Duha, S., Viruel, M.A., Saunier, R. (1998) Identification of peach varieties using molecular markers. Acta Horticulturae, 465: 69-78.
60.
Dirlewanger, E., Graziano, E., Joobeur, T., Calderé, F. G., Cosson, P., Howad, W., Arús, P. (2004) Comparative mapping and marker-assisted selection in Rosaceae fruit crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101: 9891-9896.
61.
Dirlewanger, E., Moing, A., Rothan, C., Svanella, L., Pronier, V., Guye, A., Plomion, C., Monet, R. (1999) Mapping QTLs controlling fruit quality in peach (Prunus persica (L.) Batsch). Theoretical and Applied Genetics, 98: 18-31.
62.
Dondini, L., Lain, O., Geuna, F., Banfi, R., Gaiotti, F., Tartarini, S., Bassi, D., Testolin, R. (2007) Development of a new SSR-based linkage map in apricot and analysis of synteny with existing Prunus maps. Tree Genetics & Genomes, 3: 239-249.
63.
Downey, L.D., Iezzoni, A.F. (2000) Polymorphic DNA markers in black cherry (Prunus serotina) are identified using sequences from sweet cherry, peach, and sour cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science, 125: 7680.
64.
Durham, R.E., Moore, G.A., Sherman, W.B. (1987) Isozyme banding patterns and their usefulness as genetic markers in peach. Journal of the American Society for Horticultural Science, 112: 1013-1018.
65.
Echt, C.S., Erdahl, L.A., McCoy, T.J. (1992) Genetic segregation of random amplified polymorphic DNA in diploid cultivated alfalfa. Genome 35: 84-87.
66.
Egea, J.G. Egea, J.E., Berenguer, T. (1995) Productive behaviour of apricot varieties in warm winter area. Acta Horticulturae 384: 129-133.
67.
Edwards, A, Civitello, A., Hammond, H.A., Caskey, C.T. (1991): DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American Journal of Human Genetics, 49: 746-756.
68.
Eldredge, L., Ballard, R., Baird, W. V., Abbott, A., Morgens, P., Callahan, A., Scorza, R. Monet, R. (1992) Application of RFLP analysis to genetic-linkage mapping in peaches. Hortscience, 27: 160-163.
69.
Etienne, C., Rothan, C., Moing, A., Plomion, C., Bodenes, C., Svanella-Dumas, L., Cosson, P., Pronier, V., Monet, R., Dirlewanger, E. (2002) Candidate genes and QTLs for sugar and organic content in peach [Prunus persica (L.) Batsch]. Theoretical and Applied Genetics, 105: 145-159.
97
70.
Faust, M., Surányi, D., Nyujtó, F. (1998) Origin and dissemination of apricot. Hortic. Rev., 22: 225-266.
71.
Felsenstein, J. (1989) PHYLYP Phylogeny Inference Package. Cladistics 5: 164166.
72.
Foolad, M.R., Arulsekar, S., Becerra, V., Bliss, F.A. (1995) A genetic map of Prunus based on an interspecific cross between peach and almond. Theoretical and Applied Genetics, 91: 262-269.
73.
Fujimori, S., Washio, T., Higo, K., Ohtomo, Y., Murakami, K., Matsubara, K., Kawai, J., Carninci, P., Hayashizaki, Y., Kikuchi, S., Tomita, M. (2003) A novel feature of microsatellites in plants: a distribution gradient along the direction of transcription. FEBS Letters, 554: 17–22.
74.
Georgi, L.L., Wang, Y., Yvergiaux, D., Ormsbee, T., Iñigo, M., Reighard, G., Abbott, A.G. (2002) Construction of a BAC library and its application to the identification of simple sequence repeats in peach [Prunus persica (L) Batsch]. Theoretical and Applied Genetics, 105: 1151-1158.
75.
Gerlach, H.K., Stösser, R. (1997) Patterns of random amplified polymorphic DNAs for sweet cherry (Prunus avium L.) cultivar identification. Angewandte Botanik, 71: 212–218.
76.
Geuna, F., Toschi, M., Bassi, D. (2003) The use of AFLP markers for cultivar identification in apricot. Plant Breeding, 122: 526-531.
77.
Goffreda, J.C., Nick, J.M.A., Mehlenbacher, S.A., Vorsa, N. (1991) Inheritance of isozymes in peach x Prunus kansuensis and peach x Prunus davidiana Hybrids. Eupytica, 54: 161-168.
78.
Gogorcena, Y., Parfitt, D.E. (1994) Evaluation of RAPD marker consistency for detection of polymorphism in apricot. Scientia Horticulturae, 59: 163-167.
79.
Goulao, L., Monte-Corvo, L., Oliveira, C.M. (2001) Phenetic characterization of plum cultivars by high multiplex ratio markers: Amplified fragment length polymorphisms and inter-simple sequence repeats. Journal of the American Society for Horticultural Science, 126: 72-77.
80.
Graetz, D.K. (2006) Breeding apricot cultivars for drying in Australia. Acta Horticulturae, 717: 197-198.
81.
Guilford, P., Prakash, S., Zhu, J. M., Rikkerink, E., Gardiner, S., Bassett, H., Forster, R. (1997) Microsatellites in Malus×domestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification. Theoretical and Applied Genetics, 94: 249–254.
82.
Gupta, P.K., Balyan, H.S., Sharma, P.C., Ramesh, B. (1996) Microsatellites in plants: A new class of molecular markers. Current Science, 70: 45-54.
83.
Hagen, L.S., Chaib, J., Fady, B., Decroocq, V., Bouchet, J.P., Lambert, P., Audergon, J.M. (2004). Genomic and cDNA microsatellites from apricot (Prunus armeniaca L.). Molecular Ecology Notes, 4: 742-745.
98
84.
Hagen, L.S., Khadari, B., Lambert, P., Audergon, J.M. (2002) Genetic diversity in apricot revealed by AFLP markers: species and cultivar comparisons. Theoretical and Applied Genetics, 105: 298-305.
85.
Hajósné M. (1999) Genetikai variabilitás a növénynemesítésben. Mezıgazda Kiadó, Budapest.
86.
Halász, J. (2007) A kajszi önmeddıségét meghatározó S-allél rendszer molekuláris háttere. Doktori Értekezés. Budapesti Corvinus Egyetem, Budapest.
87.
Halász, J., Pedryc, A., Hegedős, A. (2007) Origin and dissemination of the pollen-part mutated Sc-haplotype that confers self-compatibility in apricot (Prunus armeniaca). New Phytologist, 176: 792-803.
88.
Hashmi, G., Huettel, R., Meyer, R., Krusberg, L., Hammerschlag, F. (1997) RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryo callus cultures of peach. Plant Cell Reports, 16: 624-627.
89.
Hartl, D.L., Clark, A.G. (1997) Principles of population genetics, 2nd edn. Sinauer, Sunderland.
90.
He, T.M., Chen, X.S., Xu, Z., Gao, J.S., Lin, P.J., Liu, W., Liang, Q., Wu, Y. (2007) Using SSR markers to determine the population genetic structure of wild apricot (Prunus armeniaca L.) in the Ily valley of West China. Genetic Resources and Crop Evolution, 54: 563-572.
91.
Hemmat, M., Weeden, N.F., Manganaris, A.G., Lawson, D.M. (1994) Molecular marker linkage map for apple. Journal of Heredity, 85: 4-11.
92.
Hormaza, J.I. (2001) Identification of apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using microsatellite and RAPD markers. Acta Horticulturae, 546: 209-215.
93.
Hormaza, J.I. (2002) Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics, 104: 321-328.
94.
Hu, X.Y.; Ohm, H.W., Dweikat, I. (1997) Identification of RAPD markers linked to the gene PM1 for resistance to powdery mildew in wheat. Theoretical and Applied Genetics, 94: 832-840.
95.
Hurtado, M.A., Badenes, M.L., Llácer, G. (1999) Random amplified polymorphic DNA markers as a tool for apricot cultivar identification. Acta Horticulturae, 488: 281–288.
96.
Hurtado, M.A., Badenes, M.L., Llácer, G., Westman, A., Beck, E., Abbott, G.A. (2001) Contribution to apricot genetic analysis with RFLP, RAPD and AFLP markers. Acta Horticulturae, 546: 417-420.
97.
Hurtado, M.A., Westman, A., Beck, E., Abbott, G.A., Llácer, G., Badenes. M.L. (2002a) Genetic diversity in apricot cultivars based on AFLP markers. Euphytica, 127: 297-301.
98.
Hurtado, M.A., Romero, C., Vilanova, S., Abbott, A.G., Llácer, G., Badenes, M.L. (2002b) Genetic linkage maps of two apricot cultivars (Prunus armeniaca L.), and mapping of PPV (sharka) resistance. Theoretical and Applied Genetics, 105: 182-191.
99
99.
Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. (1990) PCR protocols (A Guide to Methods and Application), 3-166. Academic Press, INC., San Diego, California.
100. Jacob, H.J., Linderpaintner, K., Lincoln, S.E., Kusumi, K., Bunker, R.K., Yi-Pei, M., Ganten, D., Dzau, V.J., Lander, E.S. (1991): Genetic mapping of a gene causing hypertensive rat. Cell, 67: 213-224. 101. Janke, G. (1996) Izoenzimek változékonyságának vizsgálata hagyományos magyar kajszibarack fajtánál. Diplomamunka. Kerészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Budapest. 102. Joobeur, T., Periam, N., de Vicente, M.C., King, G.J., Arús, P. (2000) Development of a second generation linkage map for almond using RAPD and SSR markers. Genome, 43: 649-655. 103. Joobeur, T., Viruel, M.A., de Vicente, M.C., Jáuregui, B., Ballester, J., Dettori, M.T., Verde, I., Truco, M.J., Messeguer, R., Battle, I., Quarta, R., Dirlewanger, E., Arús, P. (1998) Construction of a saturated linkage map for Prunus using an almond x peach F2 progeny. Theoretical and Applied Genetics, 97: 1034-1041. 104. Jun, J.H., Chung, K.H., Jeong, S.B., Lee, H.J. (2002a) Development of RAPD and SCAR markers linked to flesh adhesion gene in peach. Book of Abstracts of the XXVI International Horticultural Congress, Toronto, Canada. p. 335. 105. Jun, J.H., Jeong, S.B., Chung, K.H. (2002b) Selection of species-specific RAPD markers and genetic relationships among Prunus taxa. Journal of the Korean Society for Horticultural Science, 43: 517-522. 106. Jung, S., Staton, M., Lee, T., Blenda, A., Svancara, R., Abbott, A., Main, D. (2008) GDR (Genome Database for Rosaceae): integrated web-database for Rosaceae genomics and genetics data. Nucleic Acids Research, 36: 1034-1040. 107. Kiss, G.B., Csanadi, G., Kalman, K., Kalo, P., Okresz, L. (1993) Construction of a basic linkage map for alfalfa using RFLP, RAPD, isozyme and morphological markers. Molecular Genetics and Genomics, 238: 129-137. 108. Kiss E.(2005) Molekuláris növénynemesítés. 194-210 p. In: Heszky L., Fésüs L., Hornok L. (Szerk.): Mezıgazdasági Biotechnológia. Agrofórum Kiadó, Budapest. 109. Kosztina, K.F. (1969) The use of varietal resources of apricots for breeding. Trud. Nikit. Bot. Sad. 40: 45-63. 110. Kovalev, N.V. (1970) Ustojcivost abricosa k klajsterosporiozu v svjazi s geograficskim I geneticeskim proishozsdeniem. In Ajzenberg, V.J. (Ed.): Abrikos. Ajastan, Yerevan, Armenia. pp. 169-172. 111. Krichen, L., Mnejja, M., Arùs, P., Marrakchi, M., Trifi-Farah, N. (2006) Use of microsatellite polymorphisms to develop an identification key for Tunisian apricots. Genetic Resources and Crop Evolution, 53: 1699-1706. 112. La Rota, M., Kantety, R.V., Yu, J.K., Sorrells, M.E. (2005) Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice, wheat, and barley. BMC Genomics, 6: 23.
100
113. Lawson, W.R, Goulter, K.C, Henry, R.J, Kong, G.A & Kochman, J.K (1996) RAPD markers for a sunflower rust resistance gene. Australian Journal of Agricultural Research, 47: 395-401. 114. Lecouls, A.C., Rubio, M.J., Cabetas, J.C., Minot, J.C., Voisin, R., Bonnet, A., Salesses, G., Dirlewanger, E., Esmenjaud, D. (1999) RAPD and SCAR markers linked to the Ma1 root-knot nematode resistance gene in Myrobalan plum (Prunus cerasifera Ehr.). Theoretical and Applied Genetics, 99: 328-335. 115. Levinson, G., Gutman, G.A. (1987) High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeats borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli K12. Nucleic Acids Research, 15: 5323–5338. 116. Li, X.Y, Su, X.Z, Chen, F. (2002) Rapid extraction of genomic DNA From leaves and bracts of dove tree (Davidia involucrata). Plant Molecular Biology Reporter, 20: 185a–185e. 117. Li, Y.C., Korol, A.B., Fahima, T., Nevo, E. (2004) Microsatellites within genes: structure, function, and evolution. Molecular Biology and Evolution, 21: 991– 1007. 118. Lisek, A., Korbin, M., Rozpara E. (2006) Using simply generated RAPD markers to distinguish between sweet cherry (Prunus avium L) cultivars. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 4: 53-59. 119. Litt, M., Luty, J.A. (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics, 44: 397-401. 120. Lopes, M.S., Sefc, K.M., Laimer M., Da Câmara Machado, A. (2002) Identification of microsatellite loci in apricot. Molecular Ecology Notes, 2: 24– 26. 121. Löschnig, J., Passecker, F. (1954) Die Marille und ihre Kultur. Öst. Agrarverlag, Wienna. 122. Lu, Z.X., Reighard, G.L., Baird, W.V., Abbott, A.G., Rajapakse, S. (1996) Identification of peach rootstock cultivars by RAPD markers. HortScience, 31: 127-129. 123. Lu, Z.X., Sosinski, B., Reighard, G.L., Baird, W.V., Abbott, A.G., (1998) Construction of a genetic linkage map and identification of AFLP markers for resistance to root-knot nematodes in peach rootstocks. Genome, 41: 199-207. 124. Lu, Z.X., Sossey-Alaoui, K., Reighard, G.L., Baird, W.V., Abbott, A.G. (1999) Development and characterization of a codominant marker linked to root-knot nematode resistance, and its application to peach breeding. Theoretical and Applied Genetics, 99: 115-122. 125. Mády, R., Szalay, L. (2003) Kajszifajták. In: Pénzes, B., Szalay, L. (Szerk.) Kajszi. Mezıgazda Kiadó, Budapest. pp. 85-126. 126. Maghuly, F., Fernandez, E.B., Ruthner, Sz., Pedryc, A., Laimer, M. (2005) Microsatellite variability in apricots (Prunus armeniaca L.) reflects their geographic origin and breeding history. Tree Genetics and Genomics, 1: 151-165.
101
127. Manganaris, A.G., Karayiannis, I., Nianiou, E. (1999b) Polymorphism and genetic studies of isozymes in apricots. Acta Horticulturae, 488: 303-308. 128. Manganaris, A.G., Mainou, A. Goudaras, A., Ledbetter C. (1999a) Identification of plum x apricot interspecific hybrids using isoenzyme polymorphism. Acta Horticulturae, 488: 361-368. 129. Manubens, A., Lobos, S., Jadue, Y., Toro, M., Messina, R. Lladser, M., Seelenfreund, D. (1999) DNA isolation and AFLP fingerprinting of nectarine and peach varieties (Prunus persica). Plant Molecular Biology Reporter, 17(3): 255267. 130. Marchese A., Tobutt K., Campisi G., Cartabellotta D., Di Martino V., Marrone G., Caruso T. (2006) Peach germplasm in Sicily: variation in phenology, morphology and molecular traits (Prunus persica (L.) Batsch); Il germoplasma autoctono del pesco (Prunus persica (L.) Batsch) in Sicilia: aspetti fenologici, morfologici e molecolari. Italus Hortus, 13: 118-122. 131. Mariniello, L., Sommella, M.G., Sorrentino, A., Forlani, M., Porta, R. (2002) Identification of Prunus armeniaca cultivars by RAPD and SCAR markers. Biotechnology Letters, 24: 749-755. 132. Markert, C.L., Moller, F. (1959) Multiple forms of enzymes: tissue, ontogenetic, and species specific patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 45:753-763. 133. Martin, G.B., Williams, J.G.K., Tanksley, S.D. (1991) Rapid identification of markers linked to a Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near-isogenic lines. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88: 2336-2340. 134. Martínez-Gómez, P., Arulsekar, S., Potter, D., Gradziel, T.M. (2003a) An extended interspecific gene pool available to peach and almond breeding as characterized using simple sequence repeat (SSR) markers. Euphytica, 131: 313322. 135. Martínez-Gómez, P., Arulsekar, S., Potter, D., Gradziel, T.M. (2003b) Relationships among peach and almond and related species as detected by SSR markers. Journal of the American Society for Horticultural Science, 128: 667671. 136. Martínez-Gómez, P., Gradziel, T.M. (2002) New approaches to almond breeding at the University of California-Davis Program. Acta Horticulturae, 591: 253-256. 137. Martínez-Gómez, P., Sánchez Pérez, R., Rubio, M., Dicenta, F., Gradziel, T.M., Sozzi, G.O. (2005) Application of recent biotechnologies to Prunus tree crop genetic improvement. Cienta E Investigacion Agraria, 32: 73-96. 138. Martins, M., Farinha, K., Ferreira, E., Cordeiro, V., Monteiro, A., Tenreiro, R., Oliveira, M. (2001) Molecular analysis of the genetic variability of portuguese almond collections. Acta Horticulturae, 546: 449-456. 139. Mase, N., Iketani, H., Sato, Y. (2007) Analysis of bud sport cultivars of peach (Prunus persica (L.) Batsch) by Simple Sequence Repeats. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 1: 20-27.
102
140. Mehlenbacher, S.A., Cociu, V., Hough, L.F. (1991) Apricots (Prunus). In: Moore, J.N., Ballington, J.R. (Eds.), Genetic resources of temperate fruit and nut crops. International Society for Horticultural Science, Wageningen, pp. 65-107. 141. Mendel, D. (1886) Versuche über Pflanzenhybriden. Verband der Naturforshung. Verein Brunn, 4: 3-47. 142. Messina, R., Lain, O., Marrazzo, M. T., Cipriani, G., Testolin, R. (2004) New set of microsatellite loci isolated in apricot. Molecular Ecology Notes, 3: 432-434. 143. Minch, E., Ruiz-Linares, A., Goldstein, D., Feldman, M. Cavalli-Sforza, L.L. (1997) Microsat v.1.5d: a computer program for calculating various statistics on 145 microsatellite allele data. http://lotka.stanford.edu/microsat/microsat.html. 144. Moissy-Cramayel, I. (1994) A molekuláris markerezés: Hatékony eszköz a nemesítık számára. MTA Növénynemesítési Bizottság GKI, Szeged. 145. Mowrey, B.D., Werner, D.J. (1990) Phylogenetic relationships among species of Prunus as inferred by isoenzyme markers. Theoretical and Applied Genetics, 80: 129-133. 146. Mullis, K.B., Faloona, F. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase chain reaction. Methods in Enzymology, 155: 350-355. 147. Nakamura, Y., Leppert, M., O'Connell, P., Wolff, R., Holm, T., Culver, M., Martin, C., Fujimoto, E., Hoff, M., Kumlin, E., White, R. (1987) Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science, 235: 1616–1622. 148. Nei, M. (1972) Genetic distance between populations. The American Naturalist,106: 283–292. 149. Nei, M. (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 70: 33213323. 150. Nei, M. (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 89: 583-590. 151. Nishitani, C., Kimura, T., Ueda, E., Howad, W., Arús, P.,Yamamoto, T. (2007) Tri-/Hexanucleotide microsatellite markers in peach derived from enriched genomic libraries and their application in Rosaceae. Breeding Science, 57: 289296. 152. Ohta, S., Nishitani, C., Yamamoto, T. (2005) Chloroplast microsatellites in Prunus, Rosaceae. Molecular Ecology Notes, 5: 837-840. 153. Ozaki, T. Shimada, T. Nakanishi, T. Yamamoto, J. Yoshida, M. (1995) RAPD analysis for parentage determination in Prunus mume Sieb Zucc. Journal of the Japanese Society For Horticultural Science, 2: 235-242. 154. Ortiz, A., Renaud, R., Calzada, I., Ritter, E. (1997) Analysis of plum cultivars with RAPD markers. Journal of Horticultural Science, 72: 1-9. 155. Page, R.D. (1996) TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in Biosciences, 12: 357-358.
103
156. Pairon, M.C., Jacquemart, A.L. (2005) Disomic segregation of microsatellites in the tetraploid Prunus serotina Ehrh. (Rosaceae). Journal of the American Society for Horticultural Science, 5: 729-734. 157. Panaud, O., Chaib, A., Sarr, A. (2002) Dynamic conservation of apricot Prunus armeniaca in saharian oases: use of AFLP markers to assess genetic diversity in traditional orchards. Euphytica, 128: 301-305. 158. Paran, I., Kesseli, R.V., Michelmore, R.W. (1991) Identification of RFLP and RAPD markers to downy mildew resistance genes in lettuce with near isogenic lines. Genome, 35: 1021-1027. 159. Paydas, S., Eti, S., Derin, K., Gulcan, R., Yilmaz, K.U. (2006) In vitro investigations on pollen quality, production and self-incompatibility of some apricot varieties in Malatya – Turkey. Acta Horticulturae, 701: 75-78. 160. Pedryc, A. (2003) A kajszi nemesítése. In: Pénzes, B., Szalay, L. (Szerk.): Kajszi, Mezıgazda Kiadó, Budapest. 161. Pedryc, A., Ruthner, Sz., Bisztray, Gy., Laimer, M. (2002) A Magyarországon termesztett kajszibarack fajták azonosítása RAPD markerekkel. VIII. Növénynemesítési Tudományos Napok Összefoglalói, 26. 162. Pedryc, A., Ruthner, Sz., Bisztray, Gy.D., Laimer, M. (2006) Characterization of different apricot cultivars grown in Hungary with SSR markers. Acta Horticulturae, 725: 691-698. 163. Pedryc, A., Ruthner, Sz., Hermán, R., Krska, B., Hegedős, A., Halász, J. (2009) Genetic diversity of apricot revealed by a set of SSR markers from linkage group G1. Scienta Horticulturae, 121: 19-26. 164. Phillips, R.L. (1994) DNA-based markers in plants. Kluwer Academic Publishers Boston. 165. Porebski, S., Bailey, L.G., Baum, B.R. (1997) Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter, 15: 8-15. 166. Pupko, T., Graur, D. (1999) Evolution of microsatellites in the yeast Saccharomyces cerevisiae: role of length and number of repeated units. Journal of Molecular Evolution, 48: 313–316. 167. Qiang, X., Xiaopeng, Deng, X. (2004) A simple protocol for isolating genomic DNA from chestnut rose (Rosa raxburghii Tratt.) for RFLP and PCR Analyses. Plant Mol. Biol Rep., 22: 301-302 168. Quarta, R., Dettori, M.T., Sartori, A., Verde, I. (2000) Genetic linkage map and QTL analysis in peach. Acta Horticulturae, 521: 233-241. 169. Quarta, R., Dettori, M.T., Verde, I., Broda, Z., Gentile, A. (1998) Genetic analysis of agronomic traits and genetic linkage mapping in a BC1 population using RFLPs and RAPDs. Acta Horticulturae, 465: 51–59. 170. Quiros, C.F., Hu, J., This, P., Chevre, A.M., Delseny, M. (1991) Development and chromosomal localization of genomic specific markers by polymerase chain reaction in Brassica. Theoretical an Applied Genetics, 82: 627-632.
104
171. Raddova, J., Beranek, M., Oukropec, I., Vachun, M., Pidra M. (2003) RAPD analysis of peaches within Czech national collection. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 39: 113-119. 172. Rajapakse, S., Belthoff, L.E., He, G., Estager, A.E., Scorza, R., Verde, I., Ballard, R.E., Baird, W.V., Callahan, A., Monet, R., Abbott, A.G. (1995) Genetic linkage mapping in peach using morphological, RFLP and RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics, 90: 503–510. 173. Regner, F., Kickenweiz, M., Hack, R. (2004) Genotyping apricots (Prunus armeniaca) by SSR markers. Mitteilungen Klosterneuburg, 54: 33-42. 174. Resta, P., Corona, M.G., Fanizza, G., Palasciano, M., Godini, A. (1998) Random amplified DNA polymorporpsms in Amygdalus communis L. Acta Horticulturae, 70: 82-90. 175. Reynolds, J., Weir, B.S., Cockerham, C.C. (1983) Estimation of the coancestry coefficient: basis for a short-term genetic distance. Genetics, 105: 767-779. 176. Ricciardi, L., Giorgio, V., de Giovanni, C., Lotti, C., Gallotta, A., Fanizza, G. (2002) The genetic diversity of Apulian apricot genotypes (Prunus armeniaca L.) assessed using AFLP markers. Cellular and Molecular Biology Letters, 7: 431436. 177. Rohlf, F.J. (1993) NTSYS-PC numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version 1.8. Exeter Publications, Setauket, N.Y., USA. 178. Rohrer, J.R., Ahmad, R., Southwick, S.M., Potter, D. (2004) Microsatellite analysis of relationships among North American plums (Prunus sect. Prunocerasus, Rosaceae). Plant Systematics and Evolution, 244: 69-75. 179. Romero, C., Pedryc, A., Munoz, V., Llacer, G., Badenes, M.L. (2003) Genetic diversity of different apricot geographical groups determined by SSR markers. Genome, 46: 244-252. 180. Romero, C., Llacer, G., Badenes, M.L., Pedryc, A. (2006) Relationship among apricot cultivars from Hungary and a South European pool determined by SSR Markers. Acta Horticulturae, 701: 233-240. 181. Ruthner, Sz., Bisztray, Gy.D., Deák, T., Laimer, M., Pedryc, A. (2003) Characterization of apricot varieties with different origin using molecular markers. Proceedings of the 4th Internaitonal Conference of PHD Students, 11-17 August, 2003: 353-357. 182. Ruthner, S., Pedryc, A., Krska, B., Romero, C., Badenes, M.L. (2006) Molecular characterisation of apricot (Prunus armeniaca L.) cultivars using cross species SSR amplification with peach primers. International Journal of Horticultural Science, 12(3): 53-57. 183. Saghai-Maroof, M.A., Biyashev, R.M., Yang, G.P., Zhang, Q., Allard, R. (1994) Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: Species diversity, chromosomal locations, and population dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91: 5466-5470.
105
184. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H. A., Arnhem, N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230: 1350-1354. 185. Salava, J., Wang, Y., Kryska, B., Polak, J., Kominek, P., Miller, W., Dowler, W.M., Reighard, G.L., Abbott, A.G. (2001) Identification of molecular markers linked to resistance of apricot (Prunus armeniaca L.) to plum pox virus. www.intl-pag.org. Plant & Animal Genome IX Conference. San Diego, USA. 186. Salesses, G., Dirlewanger, E., Esmenjaud, D., Lecouls, A.C. (1998) Root-knot nematode resistance in Myrobalan plum: inheritance and rootstock breeding perspectives using marker-assisted selection. Acta Horticulturae, 478: 45-52. 187. Sánchez-Pérez, R., Ballester, J., Dicenta, F., Arús, P., Martínez-Gómez, P. (2006a) Comparison of SSR polymorphisms using automated capillary sequencers, and polyacrylamide and agarose gel electrophoresis: Implications for the assessment of genetic diversity and relatedness in almond. Scientia Horticulturae, 108: 310-316. 188. Sánchez-Pérez, R., Ruiz, D., Dicenta, F., Egea, J., Martínez-Gómez, P. (2005) Application of simple sequence repeat (SSR) markers in apricot breeding: molecular characterisation, protection and genetic relationships. Scientia Horticulturae, 103: 305–315. 189. Sánchez-Perez, R., Ruiz, D., Dicenta, F., Egea, J., Martinez-Gomez, P. (2006b) SSR-based genetic diversity assessment among apricot cultivars and breeding lines, and its relationship with agronomic traits. Acta Horticulturae, 717: 243246. 190. Schlötterer, C., Amos, B., Tautz, D. (1991) Conservation of polymorphic simple sequence loci in cetacean species. Nature, 354: 63–65. 191. Schueler, S., Tusch, A., Schuster, M., Ziegenhagen, B. (2003) Characterization of microsatellites in wild and sweet cherry (Prunus avium L.) markers for individual identification and reproductive processes. Genome, 46: 95–102. 192. Schwartz, D. (1960) Genetic Studies on Mutant Enzymes in Maize: Synthesis of Hybrid Enzymes by Heterozygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 46(9): 1210-1215. 193. Scorza, R., Melnicenco, L., Dang, P., Abbott, A.G., Johnson, R.S., Chrisosto, C.H. (2002) Testing a microsatellite marker for selection of columnar growth habit in peach [Prunus persica (L.) Bastch]. Acta Horticulturae. 592: 285-289. 194. Serrano B., Gómez-Aparisi, J., Hormaza, J.I. (2002) Fingerprinting of Prunus rootstocks with microsatellites. Acta Horticulturae, 591: 77-81. 195. Sharopova, N. (2008) Plant simple sequence repeats: distribution, variation, and effects on gene expression. Genome, 51: 79-90. 196. Shimada, T., Haji, T., Yamaguchi, M., Takeda, T., Nomura, K., Yoshida, M. (1994) Classification of mume (Prunus mume Sieb. Et Zucc.) by RAPD assay. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 63: 543–551.
106
197. Shimada, T., Hayama, H., Haji, T., Yamaguchi, M., Yoshida, M. (1999) Genetic diversity of plums characterized by random amplified polymorphic DNA analysis. Euphytica, 109: 143-147. 198. Shulaev, V., Korban, S.S., Sosinski, B., Abbott, A.G., Aldwinckle, H.S., Folta, K.M., Iezzoni, A., Main, D., Arús, P., Dandekar, A.M., Lewers, K., Brown, S.K., Davis, T M., Gardiner, S.E., Potter, D., Veilleux, R.E. (2008) Multiple models for Rosaceae genomics. Plant Physiology, 147: 985-1003. 199. Sicard O., Marandel G., Soriano J. M., Lalli D. A., Lambert P., Salava J., Badenes M. L., Abbott A., Decroocq V. (2007) Flanking the major Plum pox virus resistance locus in apricot with co-dominant markers (SSRs) derived from candidate resistance genes. Tree Genetics & Genomes, 4: 359-365. 200. Sonneveld, T., Robbins, T.P., Boskovic, R., Tobutt, K.R. (2001) Cloning of six cherry self-incompatibility alleles and development of allele-specific PCR detection. Theoretical and Applied Genetics, 102: 1046-1055. 201. Sorkheh, K., Shiran, B., Gradziel, T.M., Epperson, B.K., Martínez-Gómez, P., Asadi, E. (2007) Amplifed fragment length polymorphism as a tool for molecular characterization of almond germplasm: genetic diversity among cultivated genotypes and related wild species of almond, and its relationships with agronomic traits. Euphytica, 156(3): 327-344. 202. Sosinski, B., Gannavarapu, M., Hager, L.D., Beck, L.E., King, G.J., Ryder, C.D., Rajapakse, S., Baird, W.V., Ballard, R.E., Abbott, A.G. (2000) Characterization of microsatellite markers in peach [Prunus persica (L.) Batsch]. Theoretical and Applied Genetics, 101: 421–428. 203. Southern, E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gelelectrophoresis. Journal of Molecular Biology, 98: 503-517. 204. Steinkellner, H., Lexer, C., Turetschek, E., Glössl, J. (1997) Conservation of (GA)n microsatellite loci between Quercus species. Molecular Ecology, 6: 1189– 1194. 205. Stockinger, E. J., Mulinix, C. A., Long, C. M., Brettin, T. S., Iezzoni, A. F. (1996) A linkage map of sweet cherry based on RAPD analysis of a microsporederived callus culture population. Journal of Heredity 87:214-218. 206. Struss, D., Boritzki, M., Glozer, K., Southwick, S.M. (2001) Detection of genetic diversity among populations of sweet cherry (Prunus avium L.) by AFLPs. ournal of Horticultural Science & Biotechnology, 76: 362-367. 207. Struss, D., Ahmad, R., Southwick, S. M., Boritzki, M. (2003) Analysis of sweet cherry (Prunus avium L.) cultivars using SSR and AFLP markers. Journal of the American Society for Horticultural Science, 128(6): 904-909. 208. Sturtevant, A.H., (1913) The linear arrangement of six-linked factors in Drosophila, as shown by their mode of association. Journal of Experimental Zoology, 14: 43-59. 209. Surányi, D. (2003) A kajszi jelentısége, termesztésének története és helyzete. In: Pénzes, B., Szalay, L. (Szerk.): Kajszi. Mezıgazda Kiadó, Budapest. pp.11–29.
107
210. Schwartz, D. (1960) Genetic studies on mutant enzymes in maize synthesis of hybrid enzymes by heterozygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 46: 1210-1215. 211. Szabó, Z., Nyéki, J. (1991) Blossoming, fructification and combination of apricot varieties. Acta Horticulturae, 293: 295-302. 212. Takeda, T., Shimada, T., Nomura, K., Ozaki, T., Haji, T., Yamaguchi, M., Yoshida, M. (1998) Classification of apricot varieties by RAPD analysis. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 67: 21-27. 213. Tao, R., Yamane, H., Sassa, H., Mori, H., Gradziel, T.M., Dandekar, A.M., Sugiura, A. (1997) Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology, 38: 304-311. 214. Tautz, D. (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA. Nucleic Acids Research, 17: 6463-6471. 215. Tautz, D., Renz, M. (1984) Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Research, 12(10): 4127-4138. 216. Tavaud, M., Zanetto, A., David, J.L., Laigret, F., Dirlewanger, E. (2004) Genetic relationships between diploid and allotetraploid cherry species (Prunus avium, Prunus gondouinii and Prunus cerasus). Heredity, 93: 631–638. 217. Tavaud, M., Zanetto, A., Santi, F., Dirlewanger, E. (2001) Structuration of genetic diversity in cultivated and wild cherry trees using AFLP markers. Acta Horticulturae, 546: 263-269. 218. Testolin, R., Marrazzo, T., Cipriani, G., Quarta, R., Verde, I., Dettori, T., Pancaldi, M., Sansavini, S. (2000) Microsatellite DNA in peach (Prunus persica (L.) Batsch) and its use in fingerprinting and testing the genetic origin of cultivars. Genome, 43: 512-520. 219. Testolin, R., Messina, R., Lain, O., Marrazzo, M. T., Huang, W. G., Cipriani, G. (2004) Microsatellites isolated in almond from an AC-repeat enriched library. Molecular Ecology Notes, 3: 459-461. 220. Timon, B. (2000) Az ıszibarack genetikai bázisa, a fajták származása. In: Timon, B. (Szerk.): İszibarack, Mezıgazda Kiadó, Budapest. pp. 42-48. 221. Torres, A.,M. (1983) Fruit trees. In: Tanksley, S.D., Orton, T.J. (Eds.): Isozymes in plant genetics and breeding. Elsevier, Amsterdam, pp. 401-421. 222. Torress, A.M., Weeden, N.F., Martin, A. (1993) Linkage among isozyme, RFLP, and RAPD markers. Plant Physiology, 101: 394-452. 223. Tóth, G., Gáspári, Z., Jurka, J. (2000) Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research, 10: 967-981. 224. Törjék O. (2001) Különbözı nyár, búza és kender genotípusok molekuláris (RAPD, SSR, AFLP, és SCAR) jellemzése. Doktori Értekezés, Gödöllı. 225. Vavilov, N.I. (1926) The mountainous districts as the home of agriculture. Studies on the origin of cultivated plants. Bulletin of Applied Botany in: Plant Breeding, 16: 218-220.
108
226. Vavilov, N.I. (1951) Phytogeographic basis of plant breeding. Chronica Botanica. pp. 13–54. 227. Verde, I., Quarta, R., Cedrola, C., Dettori, M.T., (2002) QTL analysis of agronomic traits in a BC1 peach population. Acta Horticulturae, 592: 291-297. 228. Vilanova, S., Romero, C., Abbott, A.G., Llácer, G., Badenes, M.L. (2003) An apricot (Prunus armeniaca L.) F2 progeny linkage map based on SSR and AFLP markers, mapping plum pox virus resistance and self-incompatibility traits. Theoretical and Applied Genetics, 107: 239-247. 229. Vilanova, S., Soriano, J.M., Lalli, D.A., Romero, C., Abbott, A.G., Llácer, G., Badenes, M.L. (2006) Development of SSR markers located in the G1 linkage group of apricot (Prunus armeniaca L.) using a bacterial artificial chromosome library. Molecular Ecology Notes, 6: 789-791. 230. Viruel, M.A., Madur, D., Dirlewanger, E., Pacasl, T., Kervella, J. (1998) Mapping quantitative trait loci controlling peach leaf curl resistance. Acta Horticulturae, 465: 79-87. 231. Viruel, M.A., Messeguer, R., de Vicente, M.C., Garcia-Mas, J., Puigdomenech, P., Vargas, F., Arús, P. (1995) A linkage map with RFLP isozyme markers for almond. Theoretical and Applied Genetics, 91: 964-971. 232. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Friters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. and Zabeau, M. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23: 4407-4414. 233. Wang, D., Karle,R., Brettin, T.S., Iezzoni, A.F. (1998) Genetic linkage map in sour cherry using RFLP markers. Theoretical and Applied Genetics, 97: 1217– 1224. 234. Wang, D., Karle, R., Iezzoni, A.F. (2000) QTL analysis of flower and fruit traits in sour cherry. Theoretical and Applied Genetics, 100: 535-544. 235. Wang, Y., Georgi, L.L., Zhebentyayeva, T.N., Reighard, G.L., Scorza, R., Abbott, A.G. (2002) High-throughput targeted SSR marker development in peach (Prunus persica). Genome, 45: 319-328. 236. Warburton, M.L., Bliss, F.A. (1996) Genetic Diversity in peach (Prunus persica L. Batch) revealed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and compared to inbreeding coefficients. Journal of the American Horticultural Science, 12: 1012-1019. 237. Weber, J.L. (1990) Informativness of human (dC-dA)n.(dG-dT)n polymorphisms. Genomics, 4: 524-530. 238. Welsh, J., McClelland (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, 18: 7213-7218. 239. Welsh, J., Honeycutt, R. McClelland, J.M., Sobral B.W.S. (1991) Parentage determination in maize hybrids using arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR). Theor Appl. Genet. 82:473-476. 240. Wen, X.P, Deng X.X. (2002) The extraction of genomic DNA from five species of Rosa. Seed, 126: 18-21.
109
241. White, K.D. (1970) Roman farming. Cornell University Press, Ithaca State, USA. 242. Wierdl, M., Dominska, M., Petes, T.D. (1997) Microsatellite instability in yeast: dependence on the length of the microsatellite. Genetics, 146: 769-779. 243. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., Tingey, S.V. (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18: 6531-6535. 244. Wu, J., Shu, H.R., Zhang, X.N., Zhang, K.C., Wang, L.J. (2004) Cloning and sequence analysis of AFLP-specific fragment related to fruit non-acid/acid trait of peach. Journal ot Fruit Science, 21(6): 526-529. 245. Wünsch, A., Carrera, M., Hormaza, J.I. (2006) Molecular characterization of local spanish peach (Prunus persica (L.) Batsch) germplasm. Genetic Resources and Crop Evolution, 5: 925-932. 246. Wünsch, A., Hormaza, J.I. (2002a) Cultivar identification and genetic fingerprinting of temperate fruit tree species using DNA markers. Euphytica, 125: 59–67. 247. Wünsch, A., Hormaza, J.I. (2002b) Molecular characterization of sweet cherry (Prunus avium L.) genotypes using peach (Prunus persica (L) Batsch) SSR sequences. Heredity, 89: 56-63. 248. Xie, H., Sui, Y., Chang, F.Q., Xu, Y., Ma, R.C. (2006) SSR allelic variation in almond (Prunus dulcis Mill.). Theoretical and Applied Genetics, 112: 366-372. 249. Xu, Y, Ma, R.C., Xie, H., Liu, J.T., Cao, M.Q. (2004) Development of SSR markers for the phylogenetic analysis of almond trees from China and the Mediterranean region. Genome, 47: 1091-1104. 250. Yamamoto, T., Hayashi, T. (2002) New root-knot nematode resistance genes and their STS markers in peach. Scientia Horticulturae, 96: 81-90. 251. Yamamoto, T., Mochida, K., Imai, T., Shi, I.Z., Ogiwara, I., Hayashi, T. (2002) Microsatellite markers in peach [Prunus persica (L.) Batsch] derived from enriched genomic and cDNA libraries. Molecular Ecology Notes, 2: 298-302. 252. Yamamoto, T., Shimada, T., Imai, T., Yaegaki, T., Haji, T., Matsuta, N., Yamaguchi M., Hayashi, T. (2001) Characterization of morphological traits based on a genetic linkage map in peach. Breeding Science, 51: 271-278. 253. Yon, M., RongCai, M. (2004) Identification of genetic relationship among almond accessions by AFLP. Journal of Fruit Science, 21(6): 552-555. 254. Yu, M.L., Ma, R.J., Xu, J.L., Shen, Z.J., Zhang, Z. (2004) Identification of genetic relationship of peach species by SSR. Journal of Fruit Science, 21: 106112. 255. Zhebentyayeva, T.N., Reighard, G.L., Gorina, V.M., Abbott. A.G., (2003) Microstellite (SSR) analysis for assessment of genetic variability in apricot germplasm. Theoretical and Applied Genetics, 106: 435-444. 256. Zhebentyayeva T., Reighard G., Gorina V., Abbott A. (2004) Simple sequence repeat (SSR) analysis for assessment of genetic variability in apricot germplasm. Theoretical and Applied Genetics, 106: 435-444.
110
257. Zhebentyayeva, T.N., Reighard, G.L., Lalli, D., Gorina, V.M., Krška, B., Abbott, A.G. (2008) Origin of resistance to plum pox virus in apricot: what new AFLP and targeted SSR data analyses tell. Tree Genetics and Genomes 3: 403-417. 258. Zhebentyayeva, T.N., Sivolap, Y.M. (2000) Genetic diversity of apricot determined by isoenzyme and RAPD analyses. Acta Horticulturae, 538: 525-529. 259. Zhou, L., Kappel, F., Hampson, C., Viersma, P.A., Bakkeren, G. (2002) Genetic analysis and discrirmination of sweet cherry cultivars and selections using amplified fragment length polyimorphism fingerprints. Journal of the American Society for Horticultural Science, 127: 786-792. 260. Zohary D., Hopf, M. (1994) Domestication of Plants in the Old World. Oxford University Press.
111
M2. DNS-kivonási protokollok DNS-kivonás protokoll 1 /javított amerikai bab módszer/ 1. 0,5 g fiatal levél 2. hozzáadni 200 µl extrakciós puffert 3. dörzsmozsárban folyékony nitrogénnel eldörzsölni 4. hozzáadni 200 µl extrakciós puffert 5. 1,5 ml-es eppendorf csıbe áttölteni 6. 100 µl extrakciós pufferrel átmosni a dörzsmozsarat 7. összerázni a csövet, ha kétfázisú 8. 65°C-on, 45 perc-1 óra vízfürdıben inkubálás 9. centrifuga 10000 fordulat/perc, 10 perc szobahımérséklet 10. felülúszót eppendorf csıbe átönteni 11. + kétszeres mennyiségő (kb. 1ml ) 95% alkohol+ 7,5 M ammónium-acetát (6/1 arány) csı átforgatása 12. -20°C-ra 30 perc inkubálás 13. centrifuga 5000 fordulat/perc, 5 perc 0°C 14. felülúszót kiönteni óvatosan másik eppendorf csıbe majd itatóspapírra 15. üledéket meglazítani + 300 µl TE puffer 16. a feloldódott üledékhez +10 µl RN-áz 17. 37°C-on 1 óra inkubálás centrifugálás 14000 fordulat/perc, 10 mp. 0 °C 18. ha van üledék→új csıbe 19. +1 ml 95% etanol+1 M Na-acetát (20/1)⇒tárolható 20. –20°C 30 perc inkubálás 21. centrifugálás 5000 fordulat/perc, 5 perc, 0°C 22. felülúszó leöntése (biztos módszerrel) 23. üledékhez +1 ml 70%-os alkohol 24. vortex (pár másodpercig) 25. centrifugálás 14000 fordulat/perc, 15 mp. 0°C 26. leöntés biztos módszerrel 27. lépések ismétlése: 24.+25.+26.+27. 28. steril papírvattára fülkében lecsöpögtetni 29. a kapott DNS-t 200 µl (0,1)TE pufferben feloldani
112
DNS-kivonás protokoll 2 /kajszira optimalizált CTAB -módszer/ 0,1 g fiatal levelet folyékony nitrogénben eldörzsölni 1ml extrakciós pufferrel, eppendorf csıbe rakni 2. 30 percig inkubálni, 60°C-on 3. kloroform/butanol (24/1) keverékkel összerázni, annyival, hogy az eppendorf tele legyen 4. 4500 fordulat/perc, 5 perc centrifuga 5. Üledék feletti folyékony fázist óvatosan átöntjük egy másik eppendorfba 6. 0,8-1 ml hideg 95%-os alkoholt adunk hozzá 7. 5 percig, -20°C-ra rakjuk 8. 4500 fordulat/perc, 3 perc centrifuga 9. felülúszó eltávolítása óvatosan pipettával 10. üledékhez 600 µl 1 M NaCl oldat (gyengéden feloldjuk) 11. 60°C-on, 10 perc inkubálás 12. 300 µl tisztított fenollal finoman összevegyítjük 13. 4500 fordulat/perc, 3 perc centrifuga 14. felülúszó óvatosan pipettával másik eppendorfba 15. 500 µl kloroformmal keverjük 16. 4500 fordulat/perc, 5 perc centrifuga 17. felülúszó másik eppendorfba 18. 1 ml hideg 95%-os alkoholt adunk hozzá 19. 30 percig, -20ºC-on inkubáljuk 20. 4500 fordulat/perc, 5 perc centrifuga, felúszó eltávolítása óvatosan pipettával 21. 75%-os alkohollal mossuk (alkohol leöntése óvatosan), egyszer, ha koszos, kétszer 22. steril boxban 10-15 percig szárítom, de nem hagyom teljesen kiszáradni 23. 300 µl vízben oldom 1.
113
DNS-kivonás protokoll 3 /Qiagen DNeasy Plant Mini Kit módszer/
1. 0,5 g levél eldörzsölés folyékony nitrogénben 2. mintát eppendorfba helyezni 3. 400 µl AP1 puffer hozzáadása 4. 4 µl RN-áz hozzáadása 5. rázatás vortex-szel 6. 65°C 10 perc inkubálás, 2-3-szori átforgatással 7. 130 µl AP2 puffer hozzáadása, összekeveredni és 5 perc inkubálás jégen 8. lila eppendorfba (QIAshredder) átönteni a lizátumot 9. 2 perc centrifugálás max. sebességgel 10. a szőrlet új eppendorfba kerül kb. 450 µl 11. 225 µl AP3 puffer hozzáadása 12. 450 µl etanol hozzáadása 13. keverés vágotthegyő pipettával 14. ebbıl 650 µl üledékkel együtt a fehér DNS-szőrı eppendorfba pipettával átvinni 15. 1 perc centrifugálás 8000 fordulat/perc 16. 14. és 15. lépés megismétlése a maradék lizátummal 17. DNS-szőrı áthelyezése új 2 ml-es győjtıcsıbe 18. 500 µl AW puffer és alkohol hozzáadása 19. 1 perc 8000 fordulat/perc (folyadék kiöntése) 20. 500 µl AW puffer hozzáadása 21. 2 perc centrifugálás maximum sebességgel (membrán kiszáradjon) 22. DNS-szőrıt új eppendorfba helyezzük 23. 100 µl 65°C AE puffert a membránra juttatva átmossuk 24. 5 percig szobahımérsékleten inkubáljuk 25. 1 perc centrifugálás 8000 fordulat/perc 26. 23., 24., 25. lépések megismétlése.
114
Köszönetnyilvánítás Köszönöm témavezetım, Dr. Pedryc Andrzej segítségét és támogatását, hogy ilyen hosszú idı elteltével is hitt abban, hogy be fogom fejezni a megkezdett munkát. A felkészülésem és a munkám során számos segítséget kaptam itthon és külföldön egyaránt, amiért sok köszönettel tartozom a következı Kollégáknak: Dr. Amy Iezzoni (MSU) Dr. Nathanael Hauck (MSU) Dr. Margit Laimer (BOKU) Dr. Fatemeh Maghuly (BOKU) Dr. Marissa Badenes (IVIA) Dr. José Miguel Soriano (IVIA) Dr. Bordács Sándor (MgSzH) Szani Zsolt (MgSzH) Dr. Bisztray György (BCE) Deák Tamás (BCE) Németh Noémi (VSZT)
Szeretném megköszönni a BCE Genetika és Növénynemesítés Tanszék valamennyi munkatársának segítıkészségét és kedvességét. Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom feleségemnek, aki türelemmel és megértéssel viselte az értekezés megírásának idıszakát.
115
