BAB IV Hasil dan Pembahasan Bab ini akan membahas hasil PCR, hasil penentuan urutan nukleotida, analisa in silico dan posisi residu yang mengalami mutasi dengan menggunakan program Pymol.
IV.1 PCR Multiplek Beberapa isolat MDR-TB di amplifikasi dengan metode PCR multiplek untuk melihat adanya mutasi pada nukleotida 944 kodon 315, AGC menjadi ACC. Mutasi tersebut menyebabkan primer-dalam K315 tidak akan dapat menempel pada basa kedua kodon 315 akibatnya tidak akan terjadi amplifikasi nukleotida sepanjang 0,29kb (Mokrousov et al., 2002). Apabila tidak terjadi mutasi maka akan ada amplifikasi nukleotida sepanjang 0,43kb dan 0,29kb. Hasil PCR multiplek dapat dilihat dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.
1,4kb
0,51kb 0,39kb
0,43kb
0,21kb
0,29kb
0,07kb
Gambar IV.1 Elektroforesis Gel Agarosa Hasil PCR Multiplek. Gen katG315 enam isolat MDR-TB (L10, L4, L18,L19,R2,L7), kontrol (+): isolat galur normal H37Rv, kontrol (-): air. Enam isolat dan kontrol (+) memberikan dua pita pada 0,43kb dan 0,29kb. Pita 0,29kb menunjukkan bahwa tidak ada mutasi pada gen katG kodon 315. Gambar IV.1 menunjukkan hasil PCR multiplek enam isolat MDR-TB yang tidak termutasi pada katG315. PCR multiplek isolat-isolat ini menguji ulang penelitian sebelumnya (komunikasi langsung dengan Noviana H., 2006). Berdasarkan pengujian
ini diketahui bahwa enam isolat yaitu L4, L7, L10, L18, L19 dan R2 tidak mengalami mutasi pada katG315. Fragmen DNA isolat-isolat tersebut diamplifikasi sepanjang 0,43kb, dan untuk mengkonfirmasi hasil PCR multiplek dilakukan penentuan urutan nukleotida dengan metode dideoksi Sanger.
IV.2 Hasil Penentuan Urutan Nukleotida Penentuan urutan nukleotida dengan menggunakan metode dideoksi Sanger menghasilkan elektroforegram dan urutan nukleotida enam isolat MDR-TB (L4, L7, L10, L18, L19, R2) dibandingkan dengan galur normal H37Rv. Salah satu elektroforegram (isolat L18) ditunjukkan pada gambar 2. Hasil elektroforegram isolat lainnya dapat dilihat pada lampiran. Berikut ini adalah urutan nukleotida isolat L18 hasil sekuensing, sedangkan lima isolat lainnya dapat dilihat pada lampiran. Urutan nukleotida hasil sekuensing isolat L18: TTTTTAAGCC GGCGCTCGGA GTACGACTGC CTCCTTCGGA
TTGGTCTTCG 50
GTCGCGAAAG CTGAATGGAA AGGCCCGCGT GCAAAAATCA GCCCCGTCTG 100 CAGGGGGTGT TCGTCCATCC GACCCCTATG CAGCTGGTGA TCGCGTCCTT 150 ACCGGTTCCG GTGCCATACG AGCTCTTCCA GCCCAAGCCC ATCTGCTCCA 200 GCGGAGCAGC CTCGGGTTCG GGGCCGACCA GATCGGCCGG GCCGGCGCCA 250 TGGGTCTTAC CGAAAGTGTG ACCGCCGACG ATCAGCGCCG CTGTTTCGAC 300 GTCGTTCATG GCCATGCGCC GAAACGTCTC GCGAATGTCG ACCGCCGCGG 350 CCATGGGGTC CGGGTTGCCG TTCGGCCCCT CCGGGTTCAC GTAGCATCAG 400 CCCCATCTGC AAA
413
IV.3 Analisa Homologi Analisa homologi menggunakan program Seqman DNA*star membandingkan enam isolat dengan galur normal M. tuberculosis H37Rv.
IV.3.1 Analisa Homologi Isolat L10, L18, L19 Gen katG tiga isolat (L10, L18, L19), yang ditunjukkan hanya isolat L18, dibandingkan dengan gen katG galur alami H37Rv pada nukleotida 944 dan 946
(ditunjukkan dengan tanda panah). Selain itu, dibandingkan juga dengan isolat L4 yang sifatnya MDR-TB tetapi tidak mengalami mutasi pada nukleotida 944 dan 946; dan dengan isolat L7 MDR-TB yang mengalami mutasi pada dua nukleotida tersebut. Hasil analisa homologi menunjukkan bahwa tiga isolat (L10, L18, L19) mengalami mutasi pada nukleotida 946, perubahan basa G menjadi T.
Gambar
IV.2
Elektroforegram Hasil Penentuan Urutan Nukleotida. Menggunakan metode dideoksi Sanger isolat L18. Puncak warna hijau menunjukkan basa Adenin; merah: Timin; hitam: Guanin; biru: Sitosin. Menggunakan primer KR, jumlah nukleotida 413.
H37Rv
Isolat L4, MDR-TB
946 944
946 944
946
Isolat L18, MDR-TB
944
946
Isolat L7, MDR-TB
944
Gambar IV.3 Analisa Homologi Isolat L18. Isolat L18 mengalami mutasi pada nukleotida 946, C menjadi T, kodon 316, GGC menjadi TGC; dan tidak mengalami mutasi pada nukleotida 944, kodon 315 AGC menjadi ACC. Dibandingkan dengan H37Rv dan isolat R2 MDR-TB yang tidak mengalami mutasi di dua posisi tersebut. Pembandingan juga dilakukan dengan isolat L7 yang mengalami mutasi pada posisi 946 dan 944. Garis oranye menunjukkan basa pada kodon 315, garis hijau menunjukkan basa pada kodon 316. tanda panah menunjukkan posisi nukleotida pada basa 944 dan 946. Analisa homologi asam amino H37Rv dibandingkan dengan tiga isolat (L10, L18,L19): H37Rv: 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320
901 aag agc tcg tat ggc acc gga acc ggt aag gac gcg atc acc agc ggc atc gag gtc gta Lys Ser Ser Tyr Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Ser Gly Ile Glu Val Val K S S Y G T G T G K D A I T S G I E V V
Isolat L10, L18, L19: 301 901 aag Lys K
302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320
agc tcg tat ggc acc gga acc ggt aag gac gcg atc acc agc tgc atc gag gtc gta Ser S
Ser Tyr Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Ser Cys Ile Glu Val Val S Y G T G T G K D A I T S C I E V V
Analisis data tersebut menunjukkan bahwa nukleotida 946 terletak pada kodon 316 basa pertama, GGC menjadi TGC, mengakibatkan asam amino glisin termutasi menjadi sistein. Tiga isolat ini semuanya tidak mengalami mutasi pada gen katG kodon 315. Penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa mutasi gen katG pada serin315threonin merupakan mutasi yang paling sering terjadi (Mokrousov et al., 2002). Mutasi pada kodon 315 mengakibatkan berkurangnya afinitas enzim katalase peroksidase terhadap INH (Wengenack et al., 1998) dan dapat mengubah ikatan hidrogen (Bertrand et al., 2004). Pengaruh mutasi pada kodon glisin316sistein terhadap pengikatan INH dalam enzim katalase peroksidase belum diketahui tetapi diperkirakan menjadi penyebab sifat resistensi tiga isolat (L10, L18, L19) terhadap INH.
IV.3.2 Analisa Homologi Isolat R2 Analisa homologi isolat R2 dibandingkan dengan galur alami H37Rv dan isolat L4. Hasil penjajaran ketiga gen katG M. tuberculosis tersebut menunjukkan bahwa isolat R2 mengalami mutasi pada nukleotida 869, basa sitosin berubah menjadi timin. Setelah dianalisa, ternyata nukleotida 869 berada pada kodon 290, GCT menjadi GTT, dan perubahan basa tersebut mengakibatkan asam amino alanin berubah menjadi valin. Mutasi yang pernah dilaporkan adalah pada kodon 291, asam amino alanin menjadi prolin (Fang et al., 1998). Analisa homologinya dapat dilihat pada Gambar IV.4.
Analisa homologi asam amino isolat R2 MDR-TB dibandingkan dengan asam amino galur normal H37Rv: H37RV: 281 282 841 gcc gat Ala Asp A D
283 ctg Leu L
284 gtc Val V
285 ggc Gly G
286 ccc Pro P
287 gaa Glu E
288 ccc Pro P
289 290 gag gct Glu Ala E A
291 gct Ala A
292 ccg Pro P
293 ctg Leu L
294 gag Glu E
295 cag Gln Q
296 atg Met M
297 298 ggc ttg Gly Leu G L
283 ctg Leu L
284 gtc Val V
285 ggc Gly G
286 ccc Pro P
287 gaa Glu E
288 ccc Pro P
289 290 291 292 gag gtt gct ccg Glu Val Ala Pro E V A P
293 ctg Leu L
294 gag Glu E
295 cag Gln Q
296 atg Met M
297 ggc Gly G
299 300 ggc tgg GLy Trp G W
Isolat R2: 281 282 841 gcc gat Ala Asp A D
298 ttg Leu L
299 ggc GLy G
300 tgg Trp W
944 946
H37Rv
944
Isolat R2 MDR-TB
Isolat L4 MDR-TB
869
946 869
946
869
944
Gambar IV.4 Analisa Homologi Isolat R2. Isolat R2 termutasi pada nukleotida 869, C menjadi T, basa kedua kodon 290 GCT menjadi GTT. Isolat R2 tidak mengalami mutasi pada nukleotida 944, kodon 315 (garis oranye) dan nukleotida 946, kodon 316 (garis hijau). Dibandingkan dengan H37Rv dan isolat L4 yang MDR-TB. IV.3.3 Analisa Homologi Isolat L4 Isolat L4 dibandingkan dengan H37Rv dan isolat L10. Isolat L4 mengalami mutasi pada nukleotida 795, G menjadi A, yang terletak pada kodon 265, TTG menjadi TTA, tetapi tidak menyebabkan perubahan asam amino sehingga dapat dipastikan bahwa mutasi tersebut bukan penyebab sifat resistensi terhadap INH. Dengan demikian penyebab sifat resistensi INH isolat L4 belum diketahui.
944 946 795
H37Rv
795 944
Isolat L4 MDR-TB
946
944 795
Isolat L10 MDR-TB
944
Gambar IV.5 Analisa Homologi Isolat L4. Isolat L4 mengalami mutasi pada nukleotida 795, basa G menjadi A kodon 265, CTG menjadi CTA tidak menyebabkan perubahan asam amino. Dibandingkan dengan H37RV dan isolat L10 yang MDR-TB. Isolat L4 tidak mengalami mutasi pada nukleotida 944 dan 946.
Analisa homologi asam amino isolat L4 MDR-TB dibandingkan dengan asam amino galur alami H37RV: H37RV: 261 262 263 264 781 gaa aca gcg gcg Glu Thr Ala Ala E T A A
265 ctg Leu L
266 267 atc gtc Ile Val I V
268 ggc Gly G
269 ggt Gly G
270 cac His H
271 act Thr T
272 ttc Phe F
273 274 275 276 ggt aag acc cat Gly Lys Thr His G K T H
277 ggc Gly G
278 gcc Ala A
279 ggc Gly G
280 ccg Pro P
Isolat L4 MDR-TB: 261 262 263 264 781 gaa aca gcg gcg Glu Thr Ala Ala E T A A
265 cta Leu L
266 atc Ile I
267 gtc Val V
268 ggc Gly G
269 ggt Gly G
270 cac His H
271 act Thr T
272 ttc Phe F
273 ggt Gly G
274 aag Lys K
275 acc Thr T
276 cat His H
277 ggc Gly G
278 gcc Ala A
279 ggc Gly G
280 ccg Pro P
IV.3.4 Analisa Homologi Isolat L7 Analisa homologi isolat L7 menunjukkan bahwa gen katG nya mengalami mutasi pada nukleotida 944, basa G menjadi C; dan nukleotida 946 basa G menjadi T. mutasi G944C pada kodon 315 yang mengubah asam amino serin menjadi threonin telah dibuktikan menjadi penyebab sifat resistensi terhadap INH. Tetapi, hasil PCR multiplek menunjukkan terjadi amplifikasi pada 0,43kb dan 0,29kb. Hal ini bisa terjadi karena kondisi PCR multiplek sangat sensitif sehingga ada kesalahan berpasangan pada primer-dalam (Mokrousov et al., 2002).
944 944
946
946
H37Rv
Isolat L7
Gambar IV.6 Analisa Homologi Isolat L7. Isolat L7 mengalami mutasi pada nukleotida 944, G menjadi C, kodon 315, AGC menjadi ACC; dan nukleotida 946, G menjadi T, kodon 316 GGC menjadi TGC. Analisa homologi asam amino isolat L7 dengan galur alami H37Rv: H37Rv: 301 901 aag Lys K
302 303 agc tcg Ser Ser S S
304 305 tat ggc Tyr Gly Y G
306 acc Thr T
307 308 gga acc Gly Thr G T
309 ggt Gly G
310 aag Lys K
311 gac Asp D
312 313 314 315 316 317 gcg atc acc agc ggc atc Ala Ile Thr Ser Cys Ile A I T S G I
318 gag Glu E
319 gtc Val V
320 gta Val V
Isolat L7: 301 901 aag Lys K
302 agc Ser S
303 tcg Ser S
304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 tat ggc acc gga acc ggt aag gac gcg atc acc acc Tyr Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Thr Y G T G T G K D A I T S G I
316 tgc Cys E
317 atc Ile V
318 319 320 gag gtc gta Glu Val Val V
Mutasi lainnya pada isolat L7 adalah pada nukleotida 946, mengubah basa G menjadi T, kodon 316 GGC menjadi TGC. Mutasi di posisi yang sama dengan tiga isolat lainnya. Diperkirakan mutasi pada kodon 316 ini menjadi salah satu penyebab sifat resistesi INH pada isolat L7, tetapi pengaruh pastinya belum diketahui. Mutasi lain yang sering terjadi adalah pada kodon Arg463Leu, tetapi mutasi ini telah dibuktikan tidak berhubungan dengan sifat resistensi terhadap INH (Shim et al., 1996). Beberapa mutasi yang telah dilaporkan adalah pada kodon Arg128Gln, Ala291Pro (Fang et al., 1998), dan Thr275Pro (Pym et al., 2002). His-108 yang merupakan salah satu residu pengikat INH telah dilaporkan termutasi pada isolat yang resisten INH, menjadi asam glutamate dan glutamine (Rouse et al., 1995; Rouse & Morris, 1995). Mutasi pada sisi aktif Asp-137 yang berperan penting dalam pengikatan INH belum pernah dilaporkan mengalami mutasi, tetapi mutasi yang terjadi adalah pada residuresidu di sekitarnya yaitu N138S, A139P, S140N, ataupun D142A (Zhang et al., 1992; Heym et al., 1995; Rouse et al., 1995; Cockerill et al., 1995; Musser et al., 1996). Mutan-mutan ini memberi pengaruh dengan cara mengubah konformasi lokal sehingga dapat mengganti orientasi gugus samping Asp-137 akibatnya tidak dapat mengikat INH (Jakopitsch et al., 2003).
IV.4. Visualisasi Protein Katalase Peroksidase dengan Program Pymol Thomas Bertrand, et al., pada tahun 2004 telah mengkristalkan katalase peroksidase M. tuberculosis dan telah menentukan struktur tiga dimensi protein tersebut. Data struktur kristal ini dapat dilihat pada situs publik www.ncbi.nlm.nih.gov dengan nama 1SJ2. Posisi residu-residu yang mengalami mutasi pada gen katG dapat dilihat berdasarkan struktur 1SJ2 dengan menggunakan program Pymol. Gambar IV.7 menunjukkan posisi residu 316 dan 290 yang mengalami mutasi.
A
B
Gambar IV.7 Posisi Residu yang Mengalami Mutasi. Posisi residu glisin 316 yang mengalami mutasi menjadi sistein (gambar A) ditunjukkan dengan warna merah. Posisi residu alanin 290 yang mengalami mutasi menjadi valin (gambar B) ditunjukkan dengan label merah, alanin 290 berada dalam daerah loop (warna hijau). Visualisasi struktur ruang katalase peroksidase dengan program Pymol menunjukkan residu asam amino 316 berada dekat dengan sisi aktif pengikatan INH. Gambar IV.8 menunjukkan berubahnya permukaan residu 316 akibat mutasi glisin menjadi sistein. Glisin merupakan asam amino yang paling sederhana sedangkan sistein berukuran lebih besar dan dapat membentuk ikatan disulfida dengan sistein lainnya. Tetapi pengaruh mutasi glisin316sistein ini dalam sifat resistensi terhadap INH belum diketahui. Penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa mutasi pada residu 315 mengakibatkan sifat resistensi terhadap INH karena mengakibatkan berubahnya ikatan hidrogen antara heme dan serin315 (Bertrand et al., 2004; Yue et al., 2003). Tiga isolat ini tidak mengalami mutasi pada residu 315 sehingga mutasi pada residu 316 diduga kuat menjadi penyebab sifat resistensi.
A
B
Gambar IV.8 Visualisasi Perubahan Permukaan Residu 316. (A) merah: permukaan glisin 316, kuning: permukaan serin 315. (B) simulasi berubahnya glisin316 menjadi sistein, permukaan sistein 316 lebih luas ditunjukkan dengan warna merah muda, abu-abu, dan kuning tua. Kuning: permukaan serin 315. Residu 278 hingga 312 pada enzim katalase peroksidase M. tuberculosis berada dalam daerah loop, konformasi ini sama dalam dua struktur katalase peroksidase lainnya yaitu pada Haloarcula marismortui dan Burkholderia pseudomallei. Dalam katalase peroksidase Burkholderia pseudomallei, daerah loop ini diperkirakan menjadi sisi pengikatan substrat tempat INH berinteraksi dengan enzim (Carpena et al., 2003). Tetapi Bertrand et al., dan Pieratelli et al., menyatakan bahwa dalam katalase peroksidase M. tuberculosis, daerah loop tersebut bukan merupakan sisi pengikatan INH yang terpenting. Mutasi pada residu asam amino 290 berada relatif jauh dari sisi aktifnya dan pengaruhnya terhadap sifat resistensi INH belum diketahui.
