A VÉR VIZSGÁLATA A vér olyan sajátos kötıszövet, amely folyékony sejtközötti állománnyal rendelkezik. Fı feladatai az oxigén és a szén-dioxid, valamint a vérsejtek, a tápanyagok és a víz szállítása. Ezen kívül fontos szerepe van az immunreakcióknál, a hormonok szállításában és a termoregulációban is. Összetétele, így víztartalma, ozmózisos nyomása, a sejtes elemek száma, a benne lévı fehérjék mennyisége, kationok és anionok mennyisége és aránya, valamint a pH értéke, stb. egészséges emberben viszonylag szők határok között változik. Az orvosi diagnosztikában éppen ezért ma már rutineljárás a vér plazmájának és alakos elemeinek vizsgálata, hiszen a vérsejtek számában, arányában, alakjában, továbbá az ozmotikus nyomásban, az ionok mennyiségében, az anyagok koncentrációjában, a vérplazma fehérjemennyiségében kimutatható elváltozások segítik az orvost a helyes diagnózis felállításában. Kísérleti célokból is gyakran végeznek vérvizsgálatot, hiszen számos beavatkozás (stressz, farmakonok adagolása, anyagcsere-hatások, stb.) a vér összetételének megváltozását okozhatja. Ma már sokfelé automatizált elemzı rendszerrel dolgoznak; ezek mőködése azonban csak akkor érthetı és értékelhetı megfelelıen, ha a mögöttük levı jelenségeket részleteiben is ismerjük. A most elvégzendı gyakorlatokon ilyen alapvetı jelenségeket fogunk tanulmányozni. Az emberi vér ún. alakos elemeit a vörösvértestek (vvt vagy RBC - red blood cells, angol röv.), a fehérvérsejtek (fvs vagy WBC - white blood cells, angol röv.) és a vérlemezkék vagy trombociták (thr vagy PLT - platelet, angol röv.) alkotják (ld. 1.ábra). A vérben az alakos elemek térfogati arányát a hematokrit érték adja meg, ez normálisan 36-47 % között található. A vörösvértestek a vöröscsontvelıben képzıdnek, fejlıdésük 4-5 napig tart, eközben nukleinsav tartalmuk fokozatosan lebomlik és az érett vörösvérsejtnek már nincs sejtmagja. Számuk a felnıtt ember vérében átlagosan 4,5x1012 db/L (nıkben átlagosan 4,5x1012 db/L, férfiakban valamivel magasabb, 5x1012 db/L körüli érték jellemzı). Átmérıjük kb. 7-8 µm. A vörösvértestek érésük közben hemoglobin-molekulákat szintetizálnak, melyek oxigén szállítására képesek, emellett a vörösvértestek a CO2 szállításában is részt vesznek. A vörösvérsejtek átlagos élettartama 120 nap, a lépben és a májban bomlanak le. A vér alakos elemeinek több, mint 99 %-át teszik ki. A fehérvérsejtek valódi sejtek, sejtmaggal rendelkeznek, a szervezet védekezési mechanizmusaiban játszanak fontos szerepet. Számuk átlagosan 9x109 db/L, de a 4-11x109 db/L is a normális értékhatárok közé tartozik. 3 fı típusba sorolhatóak: granulociták, monociták és limfociták. Egészséges ember fehérvérsejtjeinek 50-70 %-a granulocita, 20-40 %-a limfocita és 2-8 %-a monocita. A fiatal granulociták patkó alakú sejtmagja a sejtek érésével párhuzamosan lebenyezetté válik. Jellegzetes tulajdonságuk még a citoplazmában elıforduló, nagy mennyiségő granulum (szemcse) jelenléte - a bennük tárolt biológiailag aktív anyagoknak fontos szerepük van a gyulladásos, illetve allergiás folyamatok kialakításában. Hisztológiai festési tulajdonságaik alapján különíthetıek el a neutrofil (semleges), bazofil (lúgos) vagy eozinofil (savas) granulociták. A neutrofilek alkotják a granulociták legnagyobb mennyiségét (3-6x109 db/L). Mivel a keringésben eltöltött féléletidejük rövid (átlagosan ~6 óra), naponta igen nagy mennyiségben keletkeznek. A bakteriális fertızések elleni sejtes védelem alapját biztosítják, nagy mennyiségben képesek a szövetekbe is belépni. Granulumaikból antimikrobiális hatású fehérjék, proteolitikus hatású és oxidatív szabadgyökök elıállítására képes enzimek szabadulhatnak fel. Fagocitáló képességük miatt mikrofágoknak is nevezik ıket. Az eozinofilok száma normál körülmények mellett jóval kevesebb (1,5-3x108 db/L db/µl), elsısorban a lég-, húgy- és bélutak nyálkahártyájában találhatóak, ahol a paraziták elleni védekezésben játszanak szerepet. Az érrendszerben keringı eozinofilok száma allergiás reakciók esetén fokozódik. A bazofilok a hízósejtekhez hasonlóan granulumaikban heparint, hisztamint és más gyulladásmediátorokat is tartalmaznak. Számuk alacsony (<1x108 db/L), jelentıségük elsısorban az azonnali hiperszenzitivitási immunreakciók vagy az ún. anafilaxiás rohamok kiváltásában van. A limfociták száma normális esetben 1,5-4x109 db/L db/µl közötti tartományban mozog, az adaptív immunválasz kialakításában alapvetı fontossággal bírnak. Viszonylag kis mérető sejtek,
1
citoplazmájukat a kerek sejtmag szinte kitölti. 2 fı csoportba sorolhatóak: a T limfociták az ún. sejtes, míg a B limfociták az ún. humorális immunválasz kialakításában és az ellenanyagok termelésében játszanak szerepet. Prekurzor sejtjeik a vörös csontvelıben alakulnak ki, de a T sejtek érése a thymusban (csecsemımirigyben), míg a B sejtek érése a Bursa-ekvivalens nyirokszervekben megy végbe. A perifériás keringésben csak mintegy 2%-uk található - a limfociták döntı többsége a nyirokszervekben tartózkodik és a nyirokkeringésen keresztül jut a véráramba. A monociták a fehérvérsejtek mintegy 2-8 %-át alkotják (3-6x108 db/L), nagy mérető, vese vagy bab alakú sejtmaggal rendelkeznek. A vörös csontvelıbıl a véráramba jutnak, ahol mintegy 72h-t töltenek, majd az érfalakon átlépve ún. szöveti makrofágokká alakulnak (ilyenek pl. a máj Kupfer sejtjei, az agyi mikroglia sejtek vagy a tüdıalveolusokban található makrofágok). Aktivációjukat a T limfociták által szekretált limfokinek indítják meg, aminek hatására idegen anyagokat, így pl. baktériumokat tudnak fagocitálni és számos gyulladás-mediátort (pl. prosztaglandin E-t) szabadítanak fel. A vérlemezkék a megakariociták sejthártyával körülvett sejtplazmatöredékei, sejtmagjuk nincs. Szintén a vöröscsontvelıben keletkeznek, méretük megközelítıleg 2-5 µm. Az érpályából kilépve, ill. az egyenetlen érfalon lebomlanak, és a véralvadásban van jelentıs szerepük. Az átlagos trombocita szám 3x1011 db/L, de ennek értéke a 1,4–4,4x1011 db/L tartományban is normálisnak számít. Az ún. kvalitatív vérkép elkészítésekor a sejtes alkotóelemek abszolút számának limfocita meghatározását végzik. Ezekbıl többek monocita között vérszegénységre, vérvesztésre, kiszáradásra, a szervezetben lévı gyulladásos folyamatokra, a vérlemezke vérképzıszervekbıl kiinduló daganatos betegségre (leukémia, limfóma), illetve egyéb vérképzıszervi betegségekre (pl. vörösvértest csontvelı-elégtelenség), véralvadási zavarok granulocita okára lehet következtetni. 1. ábra. A vérben elıforduló fıbb alakos elemek. Az ún. kisrutin vérvizsgálat során a vérvételt reggel, éhgyomorra kell elvégeztetni. Ha erre nincs mód, akkor a vérvétel elıtt legalább 4 órával már ne együnk, és ne igyunk semmit. Az eredmények kortól és nemtıl is függenek! Az ember mennyiségi vérképének normálértékei: Fehérvérsejt-szám: 4 – 10 (Giga - 109 db/L) (régebben4000 - 10000 db/mikroliter vér) Vörösvértest-szám: 4-5.20 (Tera - 1012 db/L) (régebben 4 millió –5,2 db/mikroliter vér) Trombocita-szám: 140 – 440 G/L (Giga - 109 db/L) (régebben 140.000 – 440.000 db/mikroliter vér) Haemoglobin tartalom (Hb): 120-157 g/L Haematokrit (Ht): 0.36 – 0.47 L/L vagy 36 – 47 % MCV (vörösvértest átlagos térfogata):80-97 fl MCH (vvt átlagos hemoglobin-tartalma): 27 – 34 pg (pikogramm) A minıségi vérkép készítésekor a fehérvérsejtek relatív százalékos megoszlását mérik, az arányok változása különféle betegségekre utalhat. A vérsejtek alakját, nagyságát és jellegzetes tulajdonságait vékony kenetben lehet a legjobban megfigyelni. Lehetıség nyílik a sejtek tipizálására és a típusok százalékos arányának meghatározására is. A normálértékek: Fiatal alakok : 0 – 1 % (jelenléte bakteriális gyulladást jelez) Pálca (stáb): 0 – 5 % Neutrofil granulocita: 40 – 75 % Eozinofil granulocita: 0 – 5 % (magas érték leggyakrabban allergiás betegségeknél, illetve paraziták jelenlétében mutatkozik) Bazofil granulocita: 0 – 2 % Limfocita: 20 – 40 % ( magas értéke vírusfertızésre utal) Monocita: 0 – 2% ( megszaporodása a vírus,- illetve baktériumfertızés végét jelzi) Plazmasejtek (ellenanyag-termelı B limfociták): 0 – 2% Vörösvértest- süllyedés (We): mm/órában adják meg; normálértéke nıknél 20 mm/h alatt, férfiaknál 15 mm/h alatt van. Nem specifikus vizsgálat, mégis jó szolgálatot tehet, mert a magas süllyedési érték leggyakrabban gyulladásos állapotot jelez, esetleg rosszindulatú daganat vagy vashiányos vérszegénység jelenlétére utalhat.
2
Az emberi vér folyékony állománya a vérplazma, amely a testtömeg mintegy 5%-át teszi ki. 9092%-át víz alkotja, amelyben a fehérjék mellett (albuminok, globulinok, fibrinogén, illetve számos más hormon, növekedési és véralvadási faktor, stb.) szervetlen ionok, szerves anyagok (glukóz, aminosavak, zsírsavak, hormonok, stb.), bomlástermékek (karbamid, bilirubin, stb.) és gázok is szállítódnak. Az emberi vér pH-ja átlagosan 7,4, amely normális esetben csak szők határok között változik. A plazmafehérjék a véralvadási folyamat kialakítása, a tápanyagok szállítása, egyes molekulák megkötése és szállítása mellett a vérplazma kolloidozmotikus (onkotikus) nyomásának és pufferkapacitásának szabályozásában is fontos szerepet töltenek be. A szervezet folyadéktereinek és a megfelelı életmőködések fenntartásához a szervetlen ionok közül alapvetı a Na+ (142 mmol/l), K+ (4 mmol/l), Ca2+ (nem diffuzibilis, fehérjéhez kötött, diffuzibilis, komplexben kötött és ionizált, azaz szabad Ca2+, összesen 2,45-2,5 mmol/l), a Mg2+ (1 mmol/l), a Cl- (106 mmol/l) és a HCO3- (25 mmol/l) ion mennyiségének közel állandó szinten történı tartása. A vér egyes kémiai összetevıinek normálértékei: Szénhidrát – anyagcsere: Vércukor (glukóz): 4,20 –6,10 mmol/liter. Kizárólag éhgyomri eredmények értékelhetık. A 4,10 alatti érték esetén hipoglikémiáról, a kórosan magas érték esetén hiperglikémiáról beszélünk. Zsíranyagcsere: Triglicerid: 0,40 – 1,70 mmol/liter. Vegetáriánusoknál az értékek alacsonyabbak lehetnek. Koleszterin: 3,70 – 5,20 mmol/l. 50 év felett a férfiaknál 5,7, a nıknél a 6-os érték is elfogadható. A koleszterin: az egyik legfontosabb zsír. Egy részét a szervezet maga állítja elı, a többit a táplálékkal veszi fel. A koleszterinre szüksége van a szervezetnek de az összkoleszterin-értéknek nem szabad tartósan magasabbnak lennie, mert az az érelmeszesedés, a szívizomelhalás és az agyvérzés veszélyét fokozza. Fehérje-anyagcsere (a vesefunkciók vizsgálatára alkalmasak): Karbamid: 1,70 – 8,3 mmol/l. Kreatinin: nıknél 58 – 96, férfiaknál 58 – 106 µmol/l. Húgysav: nıknél 142 – 336 µmol/l, férfiaknál 142-406 µmol/l. Májenzimek (A máj ún. méregtelenítı funkcióját mérik. Alkoholfogyasztás, bizonyos gyógyszerek tartós szedése, egyes vegyszerek hatására az enzimszintek megemelkedhetnek): GOT (glutamát-oxálacetát-transzamináz): nıknél 18 – 31, férfiaknál 18-33 Unit/l. GPT (glutamát-pyruvát-transzamináz): nıknél 8 – 31, férfiaknál 8-41 U/l. Normálistól eltérı értéke krónikus májbetegség, illetve szívizominfarktus fennállására utalhat. Gamma-GT (γ-glutamiltranszpeptidáz): 7 – 32 U/l. A legfontosabb enzim a fehérje-anyagcserében. A túl magas érték a máj toxikus ártalmára (alkohol, gyógyszer) utalhat.
A véralvadás bonyolult, sok tényezıt feltételezı folyamat, magába foglalja a vér alvadását (koaguláció), valamint az alvadék lebontását (fibrinolízis). A véralvadás folyamatában a vérlemezkék, a vérplazma fibrinogéntartalma, valamint számos proteolitikus enzim játszanak nagy szerepet. Az érfal hámjának sérülését elıször reflexes érösszehúzódás követi, majd a sérülés közelében összetapadó vérlemezkékbıl kialakul az elsıdleges alvadék (fehér trombus). Az összecsapódás a vérlemezkék aktivációjával jár, melyet további mediátor-anyagok felszabadulása kísér. A véralvadás koagulációs kaszkád-folyamatai alapvetıen kétféle, az ún. kontakt aktivációs (korábban ún. belsı vagy intrinsic út) vagy az ún. szöveti faktor (korábban ún. külsı vagy extrinsic) úton indulhatnak be. A szöveti faktor az erek sérülésekor az endotél sejtekbıl szabadul fel, emellett a szabaddá váló kötıszöveti kollagén rostokon a vérplazma kininogénje és prekallikreinje is kikötıdik és aktiválódik. Mindkét útvonalra igaz, hogy a véralvadási kaszkád aktiválása során a vérplazma proenzimjei enzimatikus hasításokon keresztül, egymást követıen aktiválódnak, majd a két útvonal a trombin aktiválásánál találkozik. Az aktivált trombin a vérplazmában található fibrinogént fibrinné hasítja, ezt követıen a fibrin monomerek oldhatatlan fibrinszálakká állnak össze, amelyek közé további vérlemezkék tapadnak és kialakul az alvadék. A két útvonalat korábban egyforma jelentıségőnek gondolták, de manapság a szöveti faktorok által beindított útvonalnak a fiziológiás véralvadási folyamatokban nagyobb jelentıséget tulajdonítanak. Ha a vér az érpályán belül alvad meg és az alvadék az eret teljesen elzárja, trombózis (vérrög) alakul ki. Ha a vérrög az érfalról leválik és a véráramba kerül, embólia alakulhat ki.
3
A véralvadási kaszkád aktiválásával párhuzamosan antikoaguláns, a trombin hatását idıben és térben is korlátozó mechanizmusok, valamint fibrinolitikus folyamatok is beindulnak. Az antikoaguláns folyamatok között a trombin antitrombinhoz történı kikötése és inaktiválása jelentıs szerepet játszik - a folyamatot a heparin és a heparán-szulfát is katalizálja. A fibrinolízis során a sérült ereket elzáró, stabil alvadékot a plazmin nevő, a vérplazma plazminogénjébıl kialakuló enzim bontja le. Ha az alvadék túl nagy a lebontáshoz, akkor sok esetben az érfalhoz tapadva kötöszövetté alakul. Több esetben szükség lehet az alvadás meggátlására a levett vérben. Ezt általában kétféle úton érhetik el: a) 3,8%-os Na-citrát oldattal, amely leköti az alvadásban központi szerepet játszó Ca2+ ionokat; b) heparin-oldattal (a heparin a máj által termelt természetes véralvadásgátló anyag). Ez utóbbiból 10-15 mg kell 100 ml vér alvadásának meggátlásához. A véralvadási mechanizmusok mőködésének épségére nézve a vérzési és az alvadási idı meghatározása ad felvilágosítást. A vérzési idı a vér és a sérült szövetek együttes hatására jellemzı, kis mérető sérülés esetén értéke 2-3 perc körül van. Az alvadási idı azt az idıtartamot jelenti, amely alatt a frissen levett vérben az elsı fibrinszál megjelenik - ez normális esetben 5-6 percen belül megtörténik. Alvadási rendellenességek azonban egyes esetekben normál alvadási idı mellett is jelentkezhetnek (pl. ha a keletkezı alvadék nem elég szilárd és az érfalat nem képes elzárni). Az emberi vérátömlesztésnél vagy szerv-átültetés esetén a vér- és szöveti sejtek felszínén található vércsoport-antigének (vagy agglutinogének) típusának igen nagy jelentısége van. A vércsoport-antigének felismeréséért a vérplazmában található ellenanyagok vagy agglutininek felelısek. Számos vércsoport-rendszer ismert (pl. Colton, Kell, Kidd, stb), de a legnagyobb jelentıséggel az AB0 és az Rh vércsoport bír. Az AB0 rendszerben a vércsoport-antigének a szöveti és a vérsejteken is elıforduló, oligoszacharid oldalláncok, amelyek a sejtmembránban található fehérjékhez vagy szfingolipidekhez képesek kapcsolódni. A vércsoport típusát a terminális cukormolekula ráépítéséért felelıs transzferázt kódoló gének megléte határozza meg, amelyek domináns-negatív módon öröklıdnek. 4 féle fı vércsoporttípus létezik, az A, a B, az AB és a 0. A vércsoport-antigéneket baktériumok is hordozzák, így a születést követıen az immunrendszer baktériumok általi aktivációja során a szervezet számára idegen vércsoport-antigénekkel szembeni ellenananyagok gyorsan kialakulnak. Az A vércsoportúakban anti-B, B vércsoport esetén anti-A, 0 vércsoportúakban mind a két féle, míg ABsekben egyik féle ellenanyag sem lesz megtalálható. Ha a pl. anti-A ellenanyagot tartalmazó vérplazmába A antigénnel rendelkezı vérsejteket keverünk, hemagglutináció, azaz a vörösvértestek összecsapódása és hemolízise alakul ki. A véradás és vérátömlesztés szempontjából elsıdleges jelentıségő szabály az, hogy a donor vörösvértestjein található antigének a recipiens (befogadó) vérplazmájában megtalálható ellenanyagokkal ne reagálhassanak (vérátömlesztéskor elsısorban az alakos elemeket juttatják át a recipiens szervezetébe, így a donor vérplazmája annyira felhígul, hogy a donor antitestjei a recipiens szervezetében általában nem okozhatnak kicsapódást). Ellenkezı esetben a donor vörösvértestek összecsapódnak, majd hemolizálnak - a kiszabaduló hemoglobin magas szintje pedig a befogadó szervezetére toxikus lehet. Az Rh vércsoportot fıleg egy ún. D antigén megléte határozza meg, amely egyszerő dominánsnegatív módon öröklıdik. Az Rh+ egyénekben a vörösvértestek felszínén a D antigén megtalálható, az Rh- -okban viszont hiányzik. Az Rh+ egyénekben anti-D ellenanyag értelemszerően nem található, az Rh- -okban is csak akkor, ha elıtte Rh+ vérrel immunizálódtak. Az ún. Rh inkompatibilitás jelensége akkor lép fel, ha Rh anyának Rh+ magzata van: a szüléskor ugyanis a magzat és az anya vére keveredik, így az anya szervezete immunizálódhat, amely anti-D ellenanyagok termelıdéséhez vezet. Abban az esetben, ha a következı terhességek során a már immunizálódott Rh- asszonynak újra Rh+ magzata lenne, a placentán átjutó ellenanyagok a magzat fejlıdését súlyosan károsítanák. Ezt manapság már az anya passzív immunizálásával, azaz a szülést követıen a szervezetébe juttatott antiD ellenanyagok alkalmazásával azonban ki lehet védeni. A vércsoport-meghatározáshoz mesterségesen elıállított ellananyagokat (pl. anti-A, anti-B és anti-D szérumokat) használnak. A vizsgált vér egy-egy cseppjét az adott ellenanyagokkal külön-külön
4
összekeverve azt vizsgálják, hogy a vörösvértestek melyik szérumban csapódnak össze - az összecsapódás ebben az esetben a vizsgált vörösvértestek felszínén megtalálható antigéneket jelzi (pl. anti-A szérummal az A antigénnel rendelkezı, azaz A vércsoportú sejtek fognak reagálni; ld. 2. ábra). 2. ábra. Vércsoport-meghatározás. A vizsgált vér az anti-A szérumban kicsapódott, az anti-B és anti-D szérumban pedig nem.
ELVÉGZENDİ GYAKORLATOK: A gyakorlat célja: a vörös- és fehérvérsejtek számának (kvantitatív vérkép), a vércsoport, a vérzési és alvadási idı meghatározása, valamint a fehérvérsejtek sejttípus szerinti összetételének, a minıségi (kvalitatív) vérkép elemzése. E méréseket saját vér vagy elıre elkészített kenetek vizsgálatával végezzük. Az elıkészítés és a szükséges eszközök: minden munkahelyre egy csempe, sterilizált és egyenként elcsomagolt tárgylemezek, papírvatta, a fertıtlenítéshez 70%-os alkohol, egyszer használatos, steril vérvételi tők (ún. "vámpírka"), keverı pipetták, Bürker-kamra, Hayem- és Türkoldat, valamint petri csészék a kitöltéshez, mikroszkóp, a véralvadás vizsgálatához parafilm-darabok, stopper. A csoport részére ezeken kívül ABO és Rh szerotíp savók és elıre elkészített vérkenetek is rendelkezésre állnak. Baleset- és egészségvédelem: Az emberi vérrel történı vizsgálatok során fokozott figyelmet kell fordítani az esetleges fertızések kivédésére! Amennyiben lehetséges, mindenki csak a saját vérével dolgozzon! Ha társunknak segíteni kell, a segítınek a gumikesztyő használata kötelezı! A vérvételhez csak steril és egyszer használatos eszközöket szabad használni. Az emberi vérrel érintkezı, nem egyszer használatos eszközöket a használatot követıen a mosogatás elıtt fertıtlenítenítı oldatba kell áztatni. A véres papírvattát egy erre a célra szolgáló hulladékgyőjtıbe kell dobni, és a kommunális hulladéktól elkülönítve kell megsemmisíttetni. A munkafelületet a gyakorlatok kezdete elıtt és végeztével is fertıtleníteni kell! A vérvétel ujjbegybıl: a középsı ujj végét alkohollal alaposan fertıtlenítjük. Hüvelykujjunk segítségével a középsı ujjpercnél elszorítjuk a vérkeringést; ettıl az ujjvég kipirosodik (ha ujjbegyünk nem pirosodik ki, segíthet, ha a fertıtlenítés elıtt kezünket lefelé lógatva rázogatjuk, vagy kezünket meleg vízbe áztatjuk). Az egyszer használatos tőrıl tekeréssel eltávolítjuk a tőt védı kis sapkát, majd a "vámpírt" a fertıtlenített ujjbegyre szorítjuk és az ujjunkat alulról megtámasztva határozott mozdulattal megnyomjuk. A tőt célszerő nem az ujjbegy közepére, hanem kissé az oldalára illeszteni, így a pici sebbıl valamivel bıvebb vérzést kapunk. A használt tőt azonnal bedobjuk az asztalon elhelyezett tárolóba. A kiugró tő apró sebet ejt, amelybıl a vérvizsgálathoz elegendı mennyiségő vért nyerhetünk. A kiserkenı vér elsı cseppjét letöröljük (ez nagy mennyiségő egyéb szövetnedvet is tartalmaz), majd megkezdjük a vér levételét. A vérzés lankadása esetén masszírozással serkenthetjük azt. 1. A kvantitatív vérsejtkép megállapítása A mérés elve: A vérsejteket fixáljuk, zsugorítjuk (esetleg meg is festjük), majd Bürker-kamrában megszámoljuk az egy adott térfogategységben levı sejtek számát. A vérsejtszámot az SI rendszerben literre vonatkoztatva adják meg.
5
A vörösvérsejtek számának megállapításához nagy (piros gyönggyel jelzett), a fehérvérsejtekéhez kis (fehér gyönggyel jelzett) keverı-pipettát használunk (3.a ábra). A piros pipettában 100-szoros, a fehérben 10-szeres hígítást készíthetünk. A pipettákra ráerısítjük a gumicsövet, amelyek végén kis mőanyag szájrész található. A szájrészt a vizsgálati személy (VSZ) a szájába veszi (3.b ábra), a pipetta alsó végét pedig a saját ujjbegyén kiserkent vércseppbe mártja (3.c ábra). A gumicsın keresztüli folyamatos szívással a vért mindkét kapillárisban buborékmentesen az 1-es jelig kell felszívni. (Ha a véroszlop megszakad, a higítás mértéke nem lesz megfelelı - ilyenkor a pipettát azonnal fertıtlenítı oldattal át kell öblíteni, hogy a vér bele ne alvadjon, majd a kísérletet új pipettával újra kell kezdeni.) A VSZ a szájrészt folyamatosan a szájában tartva a vért tartalmazó pipettát az elıre kikészített fixáló oldatba mártja (3.d ábra), majd a fixáló oldatot a felsı (101-es, illetve 11-es) jelig szívja: a vörösvérsejtekhez Hayem-, a fehérvérsejtekhez Türk-oldatot kell használni. Ezt követıen a pipetta két végét ujjal be kell tapasztani és a vért és a fixálót rázással jól össze kell keverni. A sejtszámolás megkezdéséig a pipettát vízszintesen lefektetve félre lehet tenni, de a számolás elıtt közvetlenül újra össze kell keverni. A pipetta szárában levı 0,1 ml folyadékot kiszívatjuk papírvattával (ez gyakorlatilag csak fixáló oldatot tartalmaz), a számolást a kiöblösödı részben levı homogén keverékbıl végezzük.
b
c
d
3. ábra. A keverı-pipetta használata
A vérsejtszám meghatározására a Bürker-kamra szolgál (4.a ábra). A pontos sejtszámoláshoz a kamra aljzata és fedılemeze közötti résnek 0,1 mm magasnak kell lennie. A megfelelı résmagasság Türk-oldattal higított vér biztosításához a száraz Bürkerkamrára ráhelyezzük a fedılemezt, és addig nyomjuk óvatosan össze, amíg a két üvegfelszín között a 1/20 mm Newton-győrők meg nem jelennek (vigyázzunk, hogy a fedılemezt ne 1/5 mm törjük össze!). A fedılemezt könnyebben le tudjuk szorítani, ha a Bürker kamrán leszorító talp is található (pl. 4.b ábra). A rovátkált felület feletti, fedılemezzel fedett 4. ábra. A Bürker-kamra résbe a fixált és higított vért két oldalról úgy szívatjuk be, hogy a két térfelet elválasztó vályúba lehetıleg ne kerüljön folyadék (4.b ábra). A kamrát mikroszkópba téve kis nagyítással (10x objektív) végezzük a számolást. A fehér- és vörösvérsejtek számolását egymás után, külön célszerő elvégezni. Fedo lemez
6
A vörösvérsejtek számolására (4.c-d ábra) a kis négyzetek szolgálnak, amelyeknek oldalai 1/20 mm hosszúak, területük tehát 1/400 mm2, a fölöttük levı térfogat pedig 1/4000 mm3. A fehérvérsejtek számolására szolgáló nagyobb négyzetek oldala 1/5 mm, a területe 1/25 mm2, a fölötte levı hasáb térfogata 1/250 mm3. A kis négyzetekbıl 10-10, a nagyokból 20-20 darabot vegyünk a kamra felsı, illetve alsó részébıl. A cellákat ne véletlenszerően válasszuk ki, hanem elıre meghatározott mintázat (pl. 10-10 négyzet egy sorban vagy egy oszlopban) alapján haladjunk. A számolás során a cellákban teljes egészében benne levı, valamint az elıre megválasztott 2 élre (pl. a bal oldali és az alsó vonalra) esı sejtek számát határozzuk meg! A másik két oldalon levıket hagyjuk ki a számolásból. Feladat: Határozzuk meg a vizsgált vér 1 literére esı vörös- és fehérvérsejtek átlagos számát és a mérés hibáját (szórását)! Vessék össze a kapott értékeket a normális határértékekkel, az esetleges eltérések okát értelmezzék!
2. A vércsoport meghatározása A munkahelyre kikészített csempére az ujj megszúrását megelızıen cseppentsünk ki egy-egy savócseppet, ügyelve arra, hogy egymással ne keveredjenek. Célszerő egymástól messzire csöppenteni a szérumokból, és melléjük írni ellenanyag tartalmukat. Kontroll oldatként 0,9% NaCl oldatot (fiziológiás sóoldat) is készítsünk ki a csempére. Az ujjbegy megszúrását követıen az ujjbegyünkön kiserkenı vércseppbe a steril tárgylemez egyegy sarkával nyúljunk bele, majd a tárgylemezre került kis mennyiségő vért keverjük össze a csempére elızetesen elıkészített savócseppek egyikével. A folyamatot addig ismételjük, amíg a vércseppbıl az összes savócseppbe, valamint a fiziológiás sóoldatba nem juttatunk. Ügyeljünk arra, hogy a savócseppbe belemártott tárgylemez-sarokkal ne nyúljunk újra az ujjbegyünkön található vércseppbe, és arra is, hogy a különbözı oldatok egymással ne keveredjenek! A kicsapódási reakció általában néhány percet vesz igénybe. Az eredmények értékelésében segíthet, ha a vérrel kevert oldatokban a csempelapot óvatosan ide-oda mozgatva áramló mozgást idézünk. Feladat: Állapítsuk meg saját és/vagy társunk vércsoportját! A kicsapódási reakciókat rajzoljuk le, és értelmezzük a látottakat!
3. A vérzési és az alvadási idı meghatározása A vérzési idı meghatározását az ujj megszúrásának pillanatában kezdjük. Kb. 20 másodpercenként szőrıpapírral leitatjuk a vért. A megindított stoppert akkor állítjuk le, amikor harmadszor egymás után is száraz maradt a szőrıpapír. Az alvadási idı mérésekor a szúrást követıen kiserkenı legelsı cseppet letöröljük, majd az elsı tiszta vércseppet parafilm-darabkára cseppentjük és az órát elindítjuk. A cseppbe 20 másodpercenként steril injekcióstőt merítünk, majd azonnal kiemeljük. A stoppert az elsı fibrinszál megjelenésekor állítjuk le. Feladat: Határozzuk meg a saját vérzési és alvadási idınket! Vessük össze a normális értékekkel, az esetleges eltéréseket értelmezzük!
4. A kvalitatív vérkép elemzése A kenetek készítése: A vérkenet elkészítésekor a tárgylemez egyik végére egy csepp vért tesznek és egy másik lemez élével egyenletesen elkenik a felületen, majd a kenetet levegın szárítják. A kenet
7
akkor lesz egysejtnyi vastagságú, ha a tárgylemezt elızıleg megfelelıen zsírtalanították. A kvalitatív vérkép vizsgálatához Pappenheim szerint festik a kenetet. Elıször May–Grünwald-oldatot (metilénkék és eozin metilalkoholos oldata) öntenek rá, amelynek alkoholtartalma fixálja a kenetet. Kb. 3 perc múltán ugyanannyi desztillált vizet is ráöntenek, az így hígított oldatot aztán 1 perc után leöntik. Ezt követıen 3:2 arányban desztillált vízzel hígított Giemsa-oldatot (azur-eozinát vizes, glicerines oldata) öntenek a kenetre és 10 percig állni hagyják. Végül desztillált vízzel alaposan lemossák, a lemez másik oldaláról pedig metilalkohollal eltávolítják a festéket. Mindezek elvégzése a gyakorlati körülmények mellett korlátozott, így a hallgatók elıre elkészített keneteket kapnak elemzésre. A kenet vizsgálata: A festett vérkenet vizsgálatához a mikroszkóp nagyobb nagyítású, általában 40x objektívjét használjuk. A megfigyelést a lemez szélén kezdve, fokozatosan haladva közép felé egymás után keressünk fehérvérsejteket, és határozzuk meg, hogy a fehérvérsejtek mely csoportjába tartoznak (limfociták, granulociták vagy monociták)! Feladat: Jegyezzük fel a kenet számát - a kenetek között egészséges emberektıl és különbözı betegségekben szenvedıktıl származó minta is található. A vizsgálat során legalább 100 fehérvérsejt meghatározását végezzük el és jegyezzük fel, hogy melyik típusba tartoznak! Határozzuk meg a fehérvérsejtek egyes fajtáinak százalékos megoszlását, és a normális értéktıl való esetleges eltérés okára próbáljunk magyarázatot keresni!
8
